miR-214和Sema4D在卵巢癌中的功能作用及相关的分子生物学机制

发布时间：2017-03-25 13:00

  本文关键词：miR-214和Sema4D在卵巢癌中的功能作用及相关的分子生物学机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分：Semaphor in 4D在卵巢癌(癌组织及细胞株SKOV-3)中的表达及其与临床病理特征的关系目的检测卵巢癌组织及卵巢癌细胞株SKOV-3中Sema 4D的表达水平以及与卵巢癌临床病理特征的关系,初步探索Sema 4D在卵巢癌进展中的功能作用。方法通过免疫组化方法检测卵巢正常组织、卵巢良性病变组织、卵巢恶性病变组织中Sema 4D表达水平的差异。通过RT-PCR及Western blot方法检测卵巢癌细胞株SKOV-3及卵巢正常上皮细胞株IOSE80中Sema 4D的表达水平的差异。并采用SPSS 19.0统计学软件包进行数据处理分析,计量资料采用均数±标准差(x±SD)表示,免疫组织化学检测使用卡方检验(Chi-square Test),两两间比较采用t检验,以P0.05为差异有统计学意义。分析在卵巢癌(癌组织及细胞株SKOV-3)中Sema 4D的表达水平与卵巢癌临床病理特征的关系。结果1、Sema4D蛋白在卵巢正常组织、卵巢良性肿瘤组织以及卵巢恶性肿瘤组织中的阳性表达率分别为40%、53.3%和90%,组间比较差异有显著性(x2=32.845,P=0.000,P0.05)。2、Sema4D蛋白在早期(工-ⅡI期)和晚期(Ⅲ-Ⅳ期)卵巢癌组织中的阳性表达率分别为67%和100%,组间比较差异有显著性(X2=7.938,P=0.047,P0.05)。3、在卵巢癌细胞株SKOV-3和卵巢正常细胞株IOSE80中Sema4D mRNA的2-△△α值分别为：1.828±0.260和0.00317±0.00124(P=0.0022,P0.05),差异有显著性。4、Western bolt结果显示,Sema4D蛋白/β-actin分别为：1.20±0.09和0.0038±0.0009(P=0.0003,P0.05),差异有显著性。结论Sema4D在卵巢癌组织和细胞中高表达,卵巢癌组织中Sema4D的表达水平与卵巢病变的恶性程度正相关。第二部分：miR-214在SKOV-3中的表达及对其生物学行为的影响目的检测miR-214在卵巢癌细胞株SKOV-3中的表达水平,并观察miR-214的异常表达对卵巢癌细胞株SKOV-3增殖、凋亡和侵袭的影响。方法采用RT-PCR方法,检测并对比正常卵巢上皮细胞株IOSE80和卵巢癌细胞株SKOV-3中miR-214的表达情况。并通过慢病毒感染的方法,获得持续过表达miR-214的SKOV-3,采用CCK-8法观察SKOV-3的增殖变化,流式细胞仪检测SKOV-3的凋亡变化,Transwell小室实验观察侵袭能力的变化。结果1、在卵巢癌细胞株SKOV-3及正常卵巢上皮细胞株IOSE80中miR-214的相对表达量分别为：0.172±0.023和0.569±0.041,差异有统计学意义(P=0.0011,P0.05)。2、慢病毒感染SKOV-3细胞株作为实验组、对照序列感染SKOV-3细胞株作为载体对照组以及未作处理的空白对照组,miR-214的相对表达量分别为0.761±0.073,0.249±0.030和0.173±0.023。实验组miR-214的相对表达量高于载体对照组,两者之间差异有显著性(P=0.0029,P0.05)。实验组miR-214的相对表达量高于空白对照组,两者之间差异有显著性(P=0.0016,P0.05)。载体对照组与空白对照组比较,差异没有显著性(P=0.1133,P0.05)。3、在不同时间点实验组与空白对照组以及载体对照组相比,细胞增殖能力明显减弱,差异有显著性(P0.05)；空白对照组及载体对照组比较,差异没有显著性(P0.05)。4、在三组中凋亡指数(AI值)分别为：实验组(12.802±0.284)%高于空白对照组(7.638±0.338)%,差异有显著性(P0.01)；实验组高于载体对照组(7.866±0.177)%,差异有显著性(P0.001)；而空白对照组与载体对照组相比差异没有显著性(P0.05)。5、侵袭实验结果显示,实验组穿入Matrigel基质胶的SKOV-3细胞的灰度值为21.253±5.023低于空白对照组59.309±5.132,差异有显著性(P0.01)；实验组低于载体对照组55.031±5.238,差异有显著性(P0.01)。空白对照组与载体对照组比较,差异没有显著性(P0.05)。结论miR-214在卵巢癌细胞株SKOV-3中表达水平降低；上调卵巢癌细胞株SKOV-3中miR-214的表达水平,能够抑制SKOV-3的增殖和侵袭能力,促进细胞的调亡。第三部分：miR-214靶向调控Sema4D蛋白表达及其功能作用目的预测并验证Sema4D是miR-214的靶基因,阐述miR-214通过靶向调控Sema4D的表达来影响SKOV-3细胞的生物学功能。方法根据miRNA靶基因数据库来预测和筛选miR-214的靶基因为Sema4D,通过RT-PCR和Western blot方法检测上调和下调miR-214后卵巢癌细胞株内Sema4D mRNA和蛋白表达水平的变化,并通过双荧光素酶报告基因实验进行验证。结果1、通过生物信息学数据库预测Sema4D是miR-214的潜在靶基因之一。成功建立高表达miR-214的细胞株SKOV-3 mimics及低表达miR-214的细胞株SKOV-3 inhibitor。2、RT-PCR检测结果显示SKOV-3 mimics和SKOV-3 mimics control组Sema4D mRNA的相对表达量分别为：0.067±0.011和0.390±0.095,mimics组较control组明显下降,两组差异具有统计学意义(P=0.028,P0.05)。3、SKOV-3 inhibitor和SKOV-3 inhibitor control组Sema4D mRNA的相对表达量分别为：0.955±0.039和0.532±0.131,inhibitor组较inhibitor control组明显升高,两组差异具有统计学意义(P=0.037,P0.05)。4、Western blot法检测结果显示,SKOV-3 mimics组Sema 4D蛋白表达水平较SKOV-3 mimics control组显著降低,两组差异具有统计学意义(P0.05)。5、SKOV-3 inhibitor组Sema4D蛋白表达水平较inhibitor control组显著增高,两组差异具有统计学意义(P0.05)。6、双荧光素酶报告基因实验结果显示：在卵巢癌细胞株SKOV-3中共转染miR-214 mimics和野生型3’-UTR区重组载体时,细胞的荧光素酶活性较单独转染野生型组明显受到抑制,Gluc/seAP比值分别为0.411±0.013和3.408±0.211,差异有统计学意义(P=0.0001,P0.05)。7、共转染miR-214 inhibitor组和野生型3’-UTR区重组载体时,细胞的荧光素酶活性较单独转染野生型组明显增强,Gluc/seAP比值分别为8.777±0.421和3.408±0.211,差异有统计学意义(P=0.0003,P0.05)。8、共转染miR-214 mimics和突变型3’-UTR区的重组载体的细胞,细胞的荧光素酶活性较单独转染突变型组无明显变化Gluc/seAP比值分别为7.107±0.317和7.260±0.086,差异没有统计学意义(P=0.667,P0.05)。9、共转染miR-214 inhibitor和突变型3’-UTR区的重组载体的细胞,细胞的荧光素酶活性较单独转染突变型组无明显变化,Gluc/seAP比值分别为7.654±0.196和7.260±0.086,差异没有统计学意义(P=0.139,P0.05)。结论miR-214是通过在翻译及转录水平上靶向调节Sema4D蛋白水平的表达,miR-214对Sema4D有负性调控作用。
【关键词】：Sema4D miR-214 mimics 卵巢癌 慢病毒感染 双荧光素酶 靶向调控
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 一、中英文术语对照6-8
• 二、中文摘要8-14
• 1、第一部分：Semaphorin4D在卵巢癌（癌组织及细胞株SK0V-3)中的表达及其与临床病理特征的关系8-10
• 2、第二部分：miR-214在SK0V-3中的表运及对其生物学行为的巧响10-12
• 3、第三部分：miR-214靶向调控Sema4D蛋白表达及其功能作用12-14
• 三、英文摘要14-20
• 1、第一部分 Semaphorin4D在卵巢癌(癌组织及细胞株SKOV-3)中的表达及其与临床病理特征的关系14-16
• 2、第二部分 miR-214在SKOV-3中的表达及对其生物学行为的影响16-18
• 3、第三部分 miR-214靶向调控Sema 4D蛋白表达及其功能作用18-20
• 四、研究背景和立题依据20-23
• 五、第一部分：Semaphorin4D在卵巢癌(癌组织及细胞株SKOV-3)中的表达及其与临床病理特征的关系23-51
• 1、材料与方法23-39
• 2、结果及分析39-47
• 3、讨论47-49
• 4、小结49-50
• 5、结论50-51
• 六、第二部分：miR-214在SKOV-3中的表达及对其生物学行为的影响51-75
• 1、材料与方法51-60
• 2、结果60-71
• 3、讨论71-74
• 4、小结74
• 5、结论74-75
• 七、第三部分：miR-214靶向调控Sema 4D蛋白表达及其功能作用75-94
• 1、材料与方法75-86
• 2、结果及分析86-91
• 3、讨论91-93
• 4、小结93
• 5、结论93-94
• 八、全文总结94-95
• 九、参考文献95-102
• 十、综述102-117
• 1、CD100的相关性研究进展102-110
• S每嘉南，
  
  本文编号：267204
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