MG5的表达，鉴定以及在胃癌中的功能机制研究

发布时间：2017-03-26 05:08

  本文关键词：MG5的表达，鉴定以及在胃癌中的功能机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:我国是胃癌的高发区,肿瘤标志物,尤其是癌前预警分子和早诊分子是提高胃癌生存率的重要诊断工具,但是目前尚缺乏这样的分子标志物。我实验室前期制备并初步筛选了MG5-Ab,MG7-Ab等一系列胃癌相关的单抗,显示出很好的临床应用前景。但还缺乏较大规模的回顾性研究以及抗原鉴定等基础性研究。目的:研究MG5在预警,早诊和预后方面的临床价值;鉴定MG5的抗原本质;探究MG5在胃癌中的生物学功能以及相关分子机制。方法:IHC法检测MG5在大规模癌前病变(N=509;467)以及肿瘤组织中(n=747)的表达,统计学分析MG5表达与癌前进展、胃癌发生、预后的相关性;WB、IP、MS、IF、慢病毒感染等方法鉴定MG5抗体特异性识别的抗原;MTT,FACS、慢病毒感染、WB、IF、Co-IP、MS、裸鼠皮下成瘤、溶酶体结合摄取等实验研究MG5的肿瘤生物学功能以及相关分子机制。结果:一、MG5在大规模胃粘膜癌前病变人群中的预警作用我们将阴性表达组的疾病进展或癌变风险设为1,相比而言,1.MG5强阳性(++)和极强阳性(+++)的胃黏膜病变的癌前进展风险分别是3.35和5.21。2.MG5阳性(+)和强阳性(++)的癌前病变进展为胃癌的风险分别为2.51和4.12。3.MG5阳性(+/++)时,IM/DYS病变的癌发生的风险显著提高(MG5+:2.71,MG5++:6.01)。4.MG5和H.pylori双阳性或MG5单独强阳性时,癌前病变组织进展为胃癌的风险均显著增加(MG5+,HP+:2.80;MG5++,HP+:3.48;MG5++:14.68)。以上阳性结果P值均0.05。二、mg5的表达及临床病理学意义相对于癌旁组织,mg5在人类常见的八种肿瘤中表达均显著升高(p0.05),包括食管鳞癌,胃腺癌,结肠腺癌,直肠腺癌,肺鳞癌,肺腺癌,乳腺导管癌,胰腺导管癌。mg5的表达在女性胃腺癌组织中显著高于男性(p=0.028),还发现它在分化较差的乳腺导管癌中表达高于分化较好的癌(p=0.003)。mg5的表达与女性胃癌患者和伴随淋巴结转移的肺癌患者的预后呈负相关,多因素回归分析证实它是判断这两种患者预后的独立指标(p=0.015,p=0.030)。三、mg5的抗原鉴定—lamp2a我们采用胃癌细胞系sgc7901开展mg5的抗原鉴定工作,wb实验显示mg5分子量大约120kd,免疫沉淀(ip)结合wb和考马斯亮蓝染色显示mg5在120kd处明显富集,我们在120kd处进行切胶并进行质谱分析(maldi-tof/ms),结果表明mg5很可能是lamp2。wb结果显示,商品化的lamp2抗体的确可以识别mg5抗体在120kd处的ip产物。由于lamp2蛋白具有a,b,c三个亚型,我们进一步需要确定mg5对应的是哪一种亚型。我们在293t细胞中瞬时转染过表达lamp2a和lamp2b,wb结果显示商品化的lamp2抗体既可以识别lampa,也可以识别lamp2b,但mg5抗体只能识别lamp2a,表明mg5对应的蛋白是lamp2a。lamp2a的过表达和干扰实验进一步证实mg5抗体识别的是lamp2a蛋白。免疫细胞荧光实验表明mg5呈颗粒状细胞器定位,并与溶酶体示踪剂共定位于溶酶体。以上结果证实,mg5是lamp2a。四、lamp2a在胃癌细胞增殖和生存中的作用及相关机制蛋白组学筛选提示,细胞增殖调节蛋白rhoe可以和lamp2a和hsc70结合,提示它是伴侣分子介导的自噬(cma)的底物,下调lamp2a(cma也将下调)可能会上调rhoe而抑制增殖。结果证实,下调cma的限速分子lamp2a引起胃癌细胞的增殖减慢,同时伴有rhoe的表达增加;rhoe过表达可以直接抑制胃癌细胞的增殖;下调rhoe可以部分逆转lamp2a下调引起的增殖抑制。rhoe是cma(伴侣分子介导的自噬)的底物。结果提示,通过下调lmap2a抑制cma活性后其底物蛋白rhoe水平上调,是引起胃癌细胞增殖减慢的部分原因。我们的实验第一次阐明了CMA调控胃癌细胞增殖的分子机制,并发现了一个新的CMA底物蛋白RhoE。另外,我们还研究了LAMP2A在胃癌细胞氧化应激中的作用。发现下调LMAP2A抑制CMA活性后,细胞对H2O2诱导的凋亡更加敏感,过表达DJ-1可以保护细胞免受过多的凋亡;进一步发现过度氧化的DJ-1是CMA的底物蛋白,CMA障碍时,过度氧化的DJ-1不能有效降解发生积聚,部分介导了氧化应激诱导的凋亡。提示正常的CMA可以有效清除过度氧化的DJ-1,从而维持胃癌细胞氧化应激时的生存。结论:1.MG5是筛选癌变高危人群的预警分子标志物。2.MG5的表达与女性胃癌患者和伴随淋巴结转移的肺癌患者的预后呈负相关,3.MG5对应的抗原是CMA的限速分子LAMP2A。4.Rho E和过度氧化的DJ-1均是是CMA的底物蛋白,其积聚分别介导了CMA障碍引起的胃癌细胞的增殖减慢和抗凋亡能力减弱。
【关键词】：MG5 肿瘤标志物 抗原鉴定 增殖 凋亡 CMA Rho E DJ-1
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 缩略语表6-9
• 中文摘要9-12
• ABSTRACT12-15
• 前言15-16
• 文献回顾16-31
• 第一部分: MG5在胃癌高危人群中的预警作用31-41
• 1 材料31-32
• 1.1 主要试剂及仪器31
• 1.2 组织标本31-32
• 2 方法32-34
• 2.0 MG5单克隆抗体的大量制备及纯化32-33
• 2.1 免疫组织化学（IHC）33-34
• 2.2 IHC染色评分方法及统计学分析34
• 3 结果34-38
• 3.1 研究对象的基本资料：34-35
• 3.2 MG5表达与基线病变的关系：35-36
• 3.3 MG5表达与胃黏膜病变转归的关系：36-37
• 3.4 MG5表达与胃癌发展的关系：37-38
• 4 讨论38-41
• 第二部分: MG5在多种人类常见肿瘤组织中的高通量免疫组化研究41-50
• 1 材料41-42
• 1.1 组织芯片免疫组化实验材料41
• 1.2 肿瘤组织芯片41-42
• 2 方法42-43
• 2.1 组织芯片免疫组化（TMA-IHC）42-43
• 2.2 IHC染色评分方法及统计学分析43
• 3 结果43-48
• 3.1 MG5在八种常见的肿瘤组织中的表达阳性率43-45
• 3.2 MG5表达与肿瘤临床病理学参数之间的相关性45-46
• 3.3 MG5表达与肿瘤患者预后的相关性分析46-48
• 4 讨论48-50
• 第三部分 MG5的抗原鉴定50-57
• 1 材料50-51
• 1.1 细胞系50
• 1.2 抗体及主要试剂50
• 1.3 主要仪器及耗材50-51
• 2 方法51-53
• 2.1 细胞培养51
• 2.2 免疫沉淀51-52
• 2.3 Western blot52
• 2.4 质谱分析52-53
• 2.5 细胞免疫荧光53
• 2.6 慢病毒感染53
• 3 结果MG5的抗原本质是LMAP2A53-55
• 讨论55-57
• 第四部分 MG5/LAMP2A在胃癌细胞增殖中的作用及相关分子机制57-77
• 1 材料57-59
• 1.1 细胞系57
• 1.2 抗体57-58
• 1.3 主要试剂58
• 1.4 主要仪器及耗材58-59
• 2 方法59-64
• 2.1 细胞培养59
• 2.2 MTT实验59
• 2.3 平板克隆形成实验59
• 2.4 裸鼠体内成瘤实验59
• 2.5 免疫共沉淀（Co-IP）59-60
• 2.6 Western blot60-61
• 2.7 质谱分析61
• 2.8 慢病毒感染建立稳转细胞系61
• 2.9 细胞免疫荧光61-62
• 2.10 溶酶体分离纯化和溶酶体摄取实验62-63
• 2.11 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡63
• 2.12 蛋白氧化的检测63-64
• 3 结果64-73
• 3.1 下调LAMP2A/CMA抑制胃癌细胞系的增殖64-65
• 3.2 筛选调节肿瘤细胞增殖的CMA底物蛋白65-67
• 3.3 下调LAMP2A引起CMA底物蛋白Rho E的水平上调，进而抑制胃癌细胞增殖67-70
• 3.4 下调LAMP2A导致氧化的DJ-1 积聚，促进氧化应激诱导的细胞凋亡 · 654 讨论70-73
• 4 讨论73-77
• 小结77-79
• 参考文献79-101
• 附录101-106
• 个人简历和研究成果106-109
• 致谢109-110

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张积仁,张学庸,吴觉平,陈希陶,牟震先,胡家露,樊代明;检测胃癌患者血清与胃液中MGdl-Ag的诊断价值[J];细胞与分子免疫学杂志;1990年01期

  本文关键词：MG5的表达，，鉴定以及在胃癌中的功能机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：268294