新型斑马鱼模型在研究肿瘤浸润、转移和血管侵袭机制中的应用

发布时间：2020-06-30 11:10

【摘要】：第一部分新型斑马鱼肿瘤模型的建立及巨噬细胞介导的肿瘤转移机制的实验研究研究背景现在在世界范围内恶性肿瘤的发病率和死亡率越来越高,而转移常常是造成癌症病人死亡的主要原因。是什么造成了肿瘤的转移?越来越多的证据指向了肿瘤微环境。肿瘤微环境是一个复杂的由多种细胞和结构成分混合而成的综合体,包括肿瘤细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、周细胞等,肿瘤微环境可以为癌症的生长和转移提供支持。在各种被募集的细胞中,巨噬细胞存在于肿瘤进展的各个阶段而且数量巨大。一般情况下,巨噬细胞被认为是可以吞噬异物,杀灭肿瘤细胞的,起到清道夫的作用,但是在许多临床和基础研究中却发现,巨噬细胞起到了促进肿瘤生长和转移的作用。在原发肿瘤中,巨噬细胞可以诱导新生血管生成,促进肿瘤细胞的侵袭、迁移以及破坏血管进入血液循环,在肿瘤转移的过程中,巨噬细胞可以促进肿瘤细胞在转移部位的定植和生存。巨噬细胞有很多亚型,最常用的分型就是M1和M2,M1又叫做经典途径激活的巨噬细胞,与Thl辅助T细胞对病原体的反应有关,M2又叫做旁路途径激活的巨噬细胞,与Th2辅助T细胞有关。有研究认为,肿瘤组织中浸润的巨噬细胞已经由M1亚型转变为M2亚型。尽管许多研究认为肿瘤相关巨噬细胞能够促进肿瘤的转移,但这仍然存在争议。目前研究肿瘤转移的模型主要为小鼠模型,通常只能观察肿瘤发展终末期发生转移的情况,但临床实际情况是许多癌症因为转移灶才明确了诊断,而那时原发肿瘤仍然很小甚至无法探测。所以如何研究肿瘤发生早期出现转移的机制仍需要一种新的动物模型。由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到了87%,而且具有繁殖快、花费较少、实验周期短等优势,最近几十年在生物科学领域得到了广泛的应用。早在上世纪六十年代,斑马鱼就开始被用做发育遗传学中的动物模型,而直到1982年,有研究发现长期暴露在致癌物质下的斑马鱼长出了肿瘤,斑马鱼才开始被用作肿瘤模型。相比与小鼠肿瘤模型,斑马鱼模型有两个主要的优势,首先,斑马鱼不受动物数量的限制,每个实验组可以使用成百上千的胚胎,而小鼠如果每组超过10只就会耗费大量的精力和财力；其次,在小鼠中如果要对移植的肿瘤细胞显像,一般使用荧光蛋白或者生物发光,分辨率较低,而在透明的斑马鱼中则可以使用高分辨率荧光共聚焦显微镜对单细胞进行显像。我们在此前的一项研究中将荧光染料标记的肿瘤细胞植入到斑马鱼的卵周隙中,建立了一种新的肿瘤模型,斑马鱼胚胎透明的特性使我们可以从单细胞水平对肿瘤的生长和转移进行体内显像,结果发现组织缺氧可以明显的促进肿瘤细胞的转移。而在本研究中,我们试图通过引入肿瘤微环境中不同的细胞成分来建立一种全新的斑马鱼模型。目的本研究旨在使用斑马鱼胚胎建立肿瘤细胞与巨噬细胞相互作用的肿瘤微环境的模型,然后使用荧光显微镜和共聚焦显微镜动态观察肿瘤细胞的转移特性以及肿瘤细胞与其他细胞(例如巨噬细胞、内皮细胞)之间的关系。并结合临床标本对肿瘤转移的机制进行探讨,研究多种不同的细胞因子刺激对巨噬细胞性质变化的影响,评价不同的巨噬细胞亚型对肿瘤生长和转移的作用。方法1.使用不同的细胞因子(IL6、TNFα、TGFβ、IL4、IL10、LPS、IFNγ)体外刺激小鼠或者人的巨噬细胞,得到不同的巨噬细胞亚型M1和M2。2.使用磁珠分选从小鼠或人的肿瘤组织中直接得到肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)。3.将不同颜色的荧光染料标记的肿瘤细胞单独或者和巨噬细胞一起注射到受精后48h的转基因FLU:EGFP斑马鱼胚胎的卵周隙中,建立肿瘤微环境模型。4.使用荧光显微镜和共聚焦显微镜在单细胞水平动态观察肿瘤细胞、巨噬细胞和内皮细胞之间的相互作用,以及肿瘤细胞的侵袭和转移情况。结果1.成功建立了不同颜色的肿瘤细胞和巨噬细胞共存的肿瘤微环境模型。2.使用IL6和TNFα体外刺激的巨噬细胞或者从高表达IL6和TNFα的肿瘤中分离出的巨噬细胞可以明显促进肿瘤细胞的转移,而且大部分肿瘤细胞都跟巨噬细胞耦合在一起转移。从野生型LLC肿瘤中分离出的巨噬细胞只能微弱地促进肿瘤细胞地转移,而对照组使用PBS进行刺激的巨噬细胞并不能促进肿瘤细胞的转移。3.使用TGFβ、IL4和IL10共同刺激得到的或者从小鼠肿瘤组织中分离得到的M2亚型的巨噬细胞显著的促进肿瘤细胞的转移,大部分转移的肿瘤细胞都伴随着巨噬细胞。而使用LPS和IFNγ共同刺激得到的或者从小鼠肿瘤组织中分离得到的M1亚型的巨噬细胞没有表现出促进肿瘤细胞转移的特性。4.从出现转移的临床病人新鲜肿瘤组织中分离出的肿瘤相关巨噬细胞在斑马鱼模型中能够明显促进肿瘤细胞的转移,而从没有出现转移的临床肿瘤标本中分离出的巨噬细胞只能够微弱地促进肿瘤细胞的转移。结论1.成功建立了肿瘤细胞、巨噬细胞与血管内皮细胞三种细胞相互作用的肿瘤微环境模型,并可使用多种颜色进行体内显像。2.IL6和TNFα的体外刺激或者体内作用都可以改变巨噬细胞的性质,使其促进肿瘤转移。3.体外刺激或者是从肿瘤组织分离得到的M2亚型的巨噬细胞可以促进肿瘤转移,而M1亚型的巨噬细胞没有表现出这种能力。4.肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)促进肿瘤细胞转移的能力与其对应临床病人所患肿瘤是否出现转移相关联,肿瘤的转移需要通过TAMs的介导来实现。第二部分斑马鱼原位肿瘤模型的建立及视网膜母细胞瘤侵袭和转移机制的实验研究博士研究生：王健导师：孙玉萍教授研究背景视网膜母细胞瘤是儿童当中最常见的恶性肿瘤之一,发病率在眼内肿瘤居于首位,常见于视网膜核层,有家族遗传性,多发生于5岁以下儿童,可单眼、双眼先后或同时患病,极易发生转移,最常见的转移途径是从眼球的后极部开始,沿视神经入脑并向眼外蔓延,恶性程度高,死亡率高,因此早发现、早诊断和早治疗是提高生存率和降低死亡率的关键。手术治疗是目前主要的治疗手段,其他治疗手段还包括化学治疗、放射治疗、冷冻治疗、光凝治疗等。视网膜母细胞瘤的发病原因是Rb抑癌基因的全部两个等位基因失活导致了其抑癌功能的缺失,它是一种具有高度的遗传倾向的恶性肿瘤,大约40%的病人为常染色体显性遗传,Rb基因携带者的后代大约有50%的几率发病。最近,视网膜母细胞瘤作为遗传性的肿瘤模型,越来越受到研究者们的重视。最初研究者们是将分离培养的视网膜母细胞瘤细胞系例如Y79细胞注射到免疫缺陷小鼠的皮下成为移植瘤模型,或者是将肿瘤细胞注射到大鼠眼睛的玻璃体腔里建立原位瘤模型。此后,随着转基因技术的迅速发展,大量的转基因视网膜母细胞瘤小鼠模型被应用到基础研究中,例如人为的使癌基因SV40-T抗原过表达建立了LHEETATAG视网膜母细胞瘤模型,多种转基因小鼠模型的出现为研究视网膜母细胞瘤的发生机制以及新型抗肿药物的评价提供了便利,但是如何重现视网膜母细胞瘤多发于儿童的实际情况,如何在显微水平研究视网膜母细胞瘤发生早期生长和转移的机制尚缺乏理想的动物模型。目的本研究旨在使用斑马鱼胚胎建立视网膜母细胞瘤的原位癌模型,然后使用荧光显微镜和共聚焦显微镜在单细胞水平动态地观察肿瘤细胞的侵袭转移以及肿瘤细胞与血管之间的关系,并研究抗血管药物或者吗啉基对视网膜母细胞瘤生长和转移的影响。方法1.将不同的视网膜母细胞瘤细胞系注射到Flil:EGFP转基因斑马鱼胚胎眼球中的玻璃体腔,建立原位肿瘤模型。2.使用抗血管药物舒尼替尼或者抑制肿瘤血管生长因子的吗啉基作用于斑马鱼胚胎,然后在不同的时间点使用荧光显微镜和共聚焦显微镜动态观察肿瘤细胞的侵袭和转移情况以及肿瘤细胞和血管内皮细胞之间的相互作用。结果1.成功建立了视网膜母细胞瘤的斑马鱼原位肿瘤模型。2.高转移的视网膜母细胞瘤细胞系在斑马鱼模型中同样表现出了高转移特性,而非转移的视网膜母细胞瘤细胞系在本模型中没有出现转移。3.使用抗血管药物舒尼替尼或者抑制肿瘤血管生长因子的吗啉基可以明显抑制视网膜母细胞瘤的转移。结论1.不同的视网膜母细胞瘤细胞系在斑马鱼原位肿瘤模型保持了原有的转移特性,说明本斑马鱼模型很高的临床相关性。2.使用抑制血管生成的药物或手段可以抑制视网膜母细胞瘤的转移。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2;R-332

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