对不同WGA方法的评估及拷贝数变异测序技术在胚胎植入前遗传学筛查中的临床转化研究

发布时间：2017-03-29 17:23

  本文关键词：对不同WGA方法的评估及拷贝数变异测序技术在胚胎植入前遗传学筛查中的临床转化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)/胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)是在辅助生殖技术(assisted reproductive techniques,ART)时,针对于有特定遗传疾病风险的夫妇,对体外受精(in-vitro fertilization,IVF)胚胎进行活检,采用多种技术进行遗传学诊断,以选择正常胚胎进行移植,提高临床妊娠率和临床分娩率,降低流产率,是辅助生殖技术与分子生物学技术相结合而形成的一种产前诊断技术。PGS是对植入前的胚胎进行染色体非整倍进行检测,目前所用的PGD/PGS技术有聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH),全基因组扩增技术(whole genome amplification,WGA),比较基因组杂交芯片(comparative genomic hybridization arrays,a CGH),单核苷酸多态性芯片(single nucleotide polymorphism arrays,SNP),二代测序技术(next-generation sequencing technology,NGS)等。WGA是一种能对微量甚至是极微量DNA进行有效扩增的技术,其扩增产物可被多种常规分子技术用于下游的遗传学分析。尽管现有多种被优化的WGA技术,但本质上都可归于扩增前引物延伸反应(Primer extension preamplification,PEP)、简并寡核苷酸引物PCR(Degenerate oligonucleotide primer PCR,DOP-PCR)和多重置换扩增(Multipledis-placement amplification,MDA)[1]这三种方法。WGA技术已在临床广泛应用,如循环肿瘤细胞的基因分型[2],法医样本的鉴定,PGD/PGS胚胎的染色体和单基因病的基因分析等。通过ART所获得的胚胎发生染色体异常的可能性较高,这是导致胚胎植入失败、孕早期胎停育及自发性流产的重要原因。在PGD/PGS领域,a CGH和SNP芯片因能够检测胚胎24条染色体且具有较高的可靠性和准确性,而被广泛应用于鉴别整倍体与非整倍体胚胎[3,4]。无论是芯片技术还是NGS平台,都依赖于WGA技术这一关键步骤将胚胎活检样本的微量DNA高保真扩增,产生的足量DNA能够用于芯片的杂交或NGS的建库。关于WGA技术在PGD/PGS领域的应用多有研究,但是基于现有NGS平台,针对于不同WGA技术在PGD/PGS领域应用的横向研究未见报道。在PGD/PGS的临床实践中,a CGH和SNP芯片在染色体异常的检测方面显现出较高的可靠性和准确性。但是,现有的商业化的芯片平台在探针设计、探针定制以及染色体探针密度分布方面存在显著不同,此外,某些平台因检测分辨率较低难以检测出具有显著临床意义的IVF胚胎染色体异常。另外,SNP芯片在检测染色体三体和其它由于未减数分裂重组导致的染色体重复方面也存在不足。在临床实践中,从胚胎样本活检到出具检测报告,芯片平台工作流程繁琐,且需对DNA进行标记、杂交。因芯片及相关试剂费用高昂,探针数量有限等客观因素,致使芯片检测效率较低。而NGS结合强有效的生物信息学算法,使对IVF胚胎染色体异常的检测更加全面且更加经济有效,为PGD/PGS领域的发展带来新机遇。我们将NGS技术与生物信息学联合应用开发出适用于单细胞PGS分析的高分辨率拷贝数变异测序技术(Copy number variation sequencing,CNV-Seq),以解决胚胎活检样本的CNV检测问题,同时将基于PCR的Sure Plex WGA方法引入现有PGS流程,评估其检测染色体异常的效能,使CNV-Seq的临床转化应用成为可能,并有望取代a CGH及SNP芯片在PGS领域的应用,对胚胎染色体异常进行精准检测。目的1.依托所研发的CNV-Seq技术平台,对三种WGA方法——以PCR为基础的Sure Plex和MALBAC与以MDA为基础的REPLI-g,从扩增覆盖度、敏感性、特异性和可重复性等方面进行对比研究。希望通过我们的研究,将具有扩增优势的WGA方法引入现有的测序流程。2.分别用回顾性研究和双盲研究,以a CGH为金标准,利用CNV-Seq检测染色体非整倍性和非平衡易位,全面评估其检测染色体异常的效能,并进一步将CNV-Seq技术临床转化应用至PGS领域。方法1.选取6名具有临床表型的染色体疾病患者为研究对象,1名正常核型的男性为阴性对照,收集研究对象的外周血,提取基因组DNA(genomic DNA,g DNA),纯化后梯度稀释至15pg,显微操作从患者的冻融外周血中分离单细胞,分别在稀释g DNA单细胞水平和单细胞水平,对Sure Plex、MALBAC和REPLI-g三种WGA方法全基因组覆盖度、敏感性、特异性和可重复性等方面进行对比研究。2.选取24例经a CGH检测的WGA产物,其中10例WGA产物用于回顾性研究,14例WGA产物用于双盲研究,我们以a CGH为金标准,验证CNV-Seq在检测染色体非整倍体和非平衡易位方面的效能,通过直接比较a CGH和CNV-Seq对同一例胚胎单卵裂球活检的WGA产物的检测结果,来验证CNV-Seq的检测效能。选择3对需行PGS检测的夫妇进行初步的临床转化。结果1.从技术方法、产量、浓度、平均扩增产物长度、所需时间、操作难易程度等方面对Sure Plex、MALBAC和REPLI-g这三种WGA方法进行了比较,Sure Plex和MALBAC在可操作性上确有一定优势。2.Sure Plex和MALBAC这两种基于PCR的WGA方法较MDA具有更好的基因组覆盖度、较少的扩增偏倚。3.针对于低起始模板量的DNA,无论是15pg g DNA还是单细胞,基于PCR的WGA方法在扩增覆盖度、稳定性、敏感性、特异性和可重复性等方面均优于不依赖PCR的MDA技术。4.回顾性研究和双盲研究验证了CNV-Seq在检测染色体非整倍体和非平衡易位方面的效能,结果证实CNV-Seq在对染色体CNV的检测方面具有高准确率和特异性。5.CNV-Seq初步实现其临床转化应用,已成功在3对不孕不育夫妇实施,其中一对夫妇在选择染色体整倍体胚胎植入后分娩一健康女婴,使不孕不育患者真正受益。结论1.针对低起始模板量的DNA,无论是稀释g DNA单细胞水平还是单细胞水平,基于PCR的Sure Plex和MALBAC WGA方法在扩增覆盖度、稳定性、敏感性、特异性和可重复性等方面均优于不依赖PCR的REPLI-g MDA技术,联合使用CNV-Seq技术能有效对临床病理性CNVs做出诊断。2.CNV-Seq在对染色体CNV的检测方面具有高准确率和特异性,随着NGS技术的迅速发展,其有望取代a CGH及SNP芯片在PGS领域的应用,对胚胎染色体异常进行精准检测。
【关键词】：胚胎植入前遗传学筛查 全基因组扩增 二代测序 拷贝数变异 CNV-Seq 比较基因组杂交芯片
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.8
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-19
• 文献回顾19-26
• 实验一 基于二代测序技术平台，利用低起始模板量g DNA和单细胞对不同WGA方法的评估26-58
• 1 材料27-29
• 1.1 主要实验仪器27-28
• 1.2 通用耗材28
• 1.3 主要实验试剂28-29
• 2 方法29-44
• 2.1 研究对象与标本收集29
• 2.2 g DNA的提取29-30
• 2.3 g DNA的纯化30
• 2.4 g DNA纯度的检测30-31
• 2.5 g DNA浓度的测定31
• 2.6 稀释g DNA样本的制备31-32
• 2.7 显微操作分离单细胞32
• 2.8 WGA32-41
• 2.9 CNV-Seq文库的构建、质检和上机测序41-44
• 3 结果44-55
• 3.1 Sure Plex、MALBAC和REPLI-g三种WGA方法一般情况比较44
• 3.2 Sure Plex、MALBAC和REPLI-g WGA产物凝胶电泳分析44-46
• 3.3 Sure Plex、MALBAC和REPLI-g WGA产物全基因组覆盖度对比46-49
• 3.4 Sure Plex和MALBAC WGA产物全基因组覆盖度稳定性的研究49-50
• 3.5 Sure Plex、MALBAC和REPLI-g WGA产物敏感性、特异性和可重复性的研究 .. 463.6 单细胞水平验证Sure Plex50-53
• 3.6 单细胞水平验验证 Sure Plex53-55
• 4 讨论55-58
• 实验二 拷贝数变异测序技术在胚胎植入前遗传学诊断中的临床转化研究58-84
• 1 材料59-61
• 1.1 主要实验仪器59-60
• 1.2 通用耗材60
• 1.3 主要实验试剂60-61
• 2 方法61-72
• 2.1 研究方案61-62
• 2.2 PGS流程62
• 2.3 IVF、胚胎活检、胚胎玻璃化冷冻保存和复苏62-64
• 2.4 WGA64
• 2.5 Sure Plex WGA64-67
• 2.6 a CGH67-69
• 2.7 CNV-Seq文库的构建、质检和上机测序69-72
• 3 结果72-81
• 3.1 CNV-Seq检测染色体非整倍体72-76
• 3.2 CNV-Seq检测染色体非平衡易位76-77
• 3.3 CNV-Seq在PGS中的临床转化研究77-81
• 4 讨论81-84
• 小结84-85
• 参考文献85-93
• 附录93-118
• 个人简历及研究成果118-120
• 致谢120

  本文关键词：对不同WGA方法的评估及拷贝数变异测序技术在胚胎植入前遗传学筛查中的临床转化研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：275027