中药药效物质乳香酸及鞣花酸“化瘀解毒”治疗血瘀证的作用及机制

发布时间：2020-07-23 11:15

【摘要】：中医药的应用历史悠久,一直在重大疾病的防治中发挥着不可替代的作用,其疗效在国际范围内得到公认。中药的研发和应用在中国、德国、日本、印度发展迅猛,例如复方丹参滴丸、金纳多、小柴胡汤等中药制剂。近年来,心脑血管疾病严重损害人们身体健康、影响生活质量,致死率逐年升高。脑卒中和动脉粥样硬化是代表性心脑血管疾病,且动脉粥样硬化是脑卒中的重要病理基础。虽然西方医学针对这两类疾病的研究较多,但是目前仍缺少有效的治疗方式,针对疾病单一靶点、单一发病环节的药物研发已进入了瓶颈期。而中医治法治则强调对机体的整体调控、多靶点多层次防治疾病,这种理念已突显出其独特的优势。在中医药理论中,脑卒中以及动脉粥样硬化病变病因归结于“血瘀”,属于中医血瘀证的范畴。“化瘀解毒”中药治疗血瘀证在临床上取得了明确的效果,有副作用少、药物依耐性低等优势。然而,传统中药面临着诸如成分不明确、机制不清楚、临床安全性等问题,这些问题的解决是中医药得到突破性发展的关键。已有研究证实,鞣花酸和乳香酸均为“化瘀解毒”中药的药效物质基础,两者均是具有抗氧化活性的天然化合物并且有可能作用于Nrf2通路。乳香酸是“活血定痛”的中药乳香的主要药效成分,而鞣花酸广泛存在于中药石榴、赤芍、五倍子中。在传统组方中乳香和包含鞣花酸的中药常配伍合用。本课题中我们以血瘀证急性分型中的脑卒中和慢性分型中的动脉粥样硬化疾病为研究模型;作用机制探讨以经典的抗氧化应激通路Nrf2/HO-1为主;在研究AKBA和KBA的神经保护作用的实验中,采用了大鼠脑缺血再灌注模型、神经行为学评价、细胞缺氧缺糖(OGD)模型、免疫组织化学、免疫印迹等技术。在研究EA对动脉粥样硬化和血管内皮功能障碍的作用中,使用了两种高血脂小鼠模型和HVUECV细胞模型。实验内容分为以下两个部分:第一部分乳香药效物质AKBA和KBA抗脑缺血再灌注损伤的作用及机制研究乳香酸AKBA和KBA均是“化瘀解毒”中药乳香树脂提取物中主要的活性成分即药效物质基础,化学结构属于典型的五环三萜类化合物。本部分实验目的是研究AKBA和KBA作为Nrf2诱导剂在脑缺血再灌注(I/R)损伤保护的作用及其机制,进行了器官、细胞、分子多层次多维度的研究。在实验一中,我们首先证实了AKBA在大鼠体内脑I/R的保护作用。将所有SD大鼠随机分为3组:Sham组,Vehicle+I/R组,以及AKBA+I/R组。建立SD大鼠大脑中动脉阻闭(MCAO)模型。于脑缺血再灌注48 h时间点,进行神经功能行为学评价。而后处死大鼠,取脑对其TTC染色,计算脑梗死体积百分率。评价脑组织中氧化指标及其Nrf2/HO-1的蛋白表达。在实验二体外模型中,我们进一步研究AKBA的药理学机制,以大鼠脑皮层神经元细胞OGD模型模拟体内的缺血再灌注过程。以MTT法表征细胞的存活率。通过si RNA抑制的方法研究Nrf2/HO-1通路在细胞保护中的作用。实验结果如下:与损伤组相比,再灌注开始时间点注射给予AKBA,再灌注48 h时,可显著降低脑梗死体积百分率、抗神经细胞凋亡,同时诱导脑组织中Nrf2和HO-1蛋白的表达(P0.05)。在OGD模型中,AKBA同样可以诱导Nrf2和HO-1蛋白的表达,并且保护细胞免受OGD的氧化损伤。AKBA显著诱导Nrf2-ARE的结合活性(P0.05)。然而,Nrf2和HO-1的敲除可以减弱AKBA介导的保护作用(P0.05)。这些结果均表明,AKBA可以通过Nrf2/HO-1通路在脑I/R损伤中发挥神经保护作用以及抗氧化应激作用。本课题对乳香的另外一种药效物质乳香酸KBA的脑保护作用也进行了研究。在实验三中,体内研究模型同样采用的是雄性大鼠MCAO模型。在缺血再灌注1 h后给予KBA,于再灌注48 h后和损伤组进行比较,发现KBA显著降低脑梗死体积,同时改善神经功能评分。实验结果证实给予大鼠KBA,能够有效降低MDA水平,同时改善SOD的活性(P0.05),以及调控诱导氧化还原通路Nrf2/HO-1。在原代培养的胶质细胞OGD模型中,我们同样发现KBA具有抗氧化的细胞保护作用,并且通过si RNA实验进一步证明了Nrf2/HO-1机制在细胞保护中的重要作用。这些发现支持了KBA通过调控Nrf2/HO-1通路发挥抗I/R损伤的保护作用的结论。第二部分鞣花酸基于Nrf2/HO-1通路抗动脉粥样硬化及内皮功能保护的作用本部分实验的目的是探讨“化瘀解毒”中药药效物质之一鞣花酸(EA)在防治内皮功能障碍及动脉粥样硬化中的作用及其维持氧化还原平衡的机制。在动物实验中,模型选择的是WT小鼠和Apoe-/-小鼠的高脂饮食模型进行药效学评价,实验分组均为高脂饮食组(HFD)和高脂饮食加EA组(HFD+EA),持续时间为14周。各组小鼠的血管进行体外器官水平的血管舒张反应性实验。体外实验选择的是HVUECV的HOCl氧化损伤模型,对EA的抗氧化细胞保护作用进行评价。实验一结果发现,与单独给予高脂饮食组相比,EA可以有效缓解动脉粥样硬化的进程(P0.05)。在体外器官水平的实验二中,我们发现在动脉粥样硬化模型的血管环中,EA可以显著改善内皮依赖的血管舒张功能以及缓解HOCl引起的内皮功能障碍(P0.05)。另外,EA也可以显著改善NO合成酶活性,以及血液抗氧化指标和内皮功能标志物(P0.05)。Western blot分析结果显示,EA可以显著诱导血管组织中Nrf2和HO-1的表达(P0.05)。在实验二中,我们发现EA可以保护来自于WT小鼠的血管免受氧化损伤,但是这种效果在Nrf2-/-小鼠的血管氧化模型中并不存在(P0.05),提示Nrf2在EA的抗氧化保护作用中是关键蛋白。在实验三体外HVUECV细胞模型中,我们发现EA可以预防HOCl诱导的细胞损伤,同时明显增强HO-1的表达(P0.05)。然而,EA所发挥的细胞保护作用均被Nrf2-si RNA显著抑制(P0.05)。这些结果进一步证明了EA的由Nrf2介导的抗动脉粥样硬化和内皮功能改善作用。本课题基于国科金(No.81373947)分别在两部分实验中探索血瘀证治疗的潜在药物、机制和靶点。以血瘀证为研究模型,以“化瘀解毒”中药药效物质乳香酸和鞣花酸为工具药物,旨在探索血瘀证病机以及对证中药药效物质在宏观层次上的“化瘀”作用以及微观水平上的“解毒”作用,以期丰富“化瘀解毒”治疗血瘀证的生物学内涵。本课题中我们首次证实了乳香酸的脑保护作用以及鞣花酸的抗氧化的防治动脉粥样硬化的作用,基于所得的研究结果,我们还将在未来的工作中对两类药效物质的协同作用及剂型的优化进行更进一步的研究。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285
【图文】：

图 1. 全球脑卒中死亡率分布图[22]中的病理机制及脑损伤过程非常复杂，是缺血损失和血液再灌注引起应的综合结果。这些机制在脑卒中发病的整个过程中相互关联相互影响括：能量代谢障碍机制、兴奋性氨基酸毒性机制、氧化应激机制、炎症机机制等。ROS 氧化损伤是脑卒中的关键病理机制，参与脑卒中以及后注损伤，同时脑组织也极易受到 ROS的攻击损坏。因此，抗氧化治疗中 I/R 损伤的研究热点和方向之一[23]。

图 2. 氧化应激损伤参与脑卒中的过程[24]S 是导致脑卒中最重要的病理基础，由于生活水平提高、饮食结构的改变、化程度的加重，AS患病人群日渐增多，使其成为当前全世界医学研究的热AS 引起脑卒中是一个慢性进行性病理过程，AS 发展形成斑块，继而形成脑有的研究认为，AS是多种因素包括炎症、感染等导致内皮损伤，以内皮功起点事件，继而形成脂质沉积、脂质条纹和泡沫细胞，逐渐出现 AS斑块。引起血管狭窄。如果形成血栓则会引起血管的堵塞，或者出现斑块脱落堵塞严重的后果，最终导致脑卒中或脑梗死的发作[17]。化应激存在于 AS从脂纹病变到斑块破裂的整个发病进程中，同时介导了血胞、平滑肌细胞及单核巨噬细胞损伤[25]。机体或细胞内氧自由基的产生与，致使 ROS 在体内大量蓄积并导致组织和细胞的损伤。氧化应激为 AS 重因素之一。ROS 可以损伤内皮依赖的血管扩张、损伤内皮细胞或能够诱导

图 3. AS 过程中的氧化应激损伤[25]大量流行病学调查证实，长期的水果、蔬菜的摄入有益于降低心亡率，这些积极的作用与其含有的抗氧化物质密切相关[26]。体补充维生素、胡萝卜素等抗氧化物质对 AS及脑卒中具有防治效药效物质，酚类成分包括类黄酮物质、多酚类化合物、酚酸等，物，对心脑血管疾病的防治也有显著效果[28, 29]。1 通路与心脑血管疾病uclear factor erythroid-2-related factor 2）是调节氧化还原平衡的在转录水平控制多种抗氧化酶及ē相解毒酶的表达活性[30]。Nrf族的一员，含有六个的功能区（Nehl 到 Neh6）。在多种器官（

本文编号：2767252