经Hutat2:Fc基因修饰的人单核细胞源性巨噬细胞抗HIV相关神经认知紊乱的实验研究

发布时间：2020-08-13 12:56

【摘要】：研究背景和目的:HIV-1反式激活因子Tat对HIV的复制至关重要,也是导致HIV相关神经认知功能紊乱(HIV-associated neurocognitive disorder,HAND)的重要神经毒性因子。抗逆转录病毒治疗不能有效抑制脑内HIV的复制,且不能阻止病毒早期蛋白尤其是Tat的产生,尚不能彻底治愈HAND。HIV感染一旦建立,脑内的HIV感染的巨噬细胞和胶质细胞可不断释放Tat至细胞外,由此产生直接和间接的神经毒性。因此,设法在脑内产生稳定的抗Tat抗体将可中和Tat,保护神经细胞。本研究将构建人源化抗Tat单链抗体-Fc融合蛋白Hutat2:Fc,通过慢病毒载体转导至人单核细胞系、神经细胞系和原代人单核细胞源性巨噬细胞(human monocyte-derived macrophages,hMDM),观察其在不同细胞中的表达情况,并评价Hutat2:Fc融合蛋白的生理学功能及潜在的副作用。单核/巨噬细胞可自由的通过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB),是较为理想的中枢神经系统药物或基因递送载体,以此为载体的治疗方法的建立需要很好的了解体外培养的单核细胞在炎症情况下经外周循环向脑内迁徙效率。故本研究还将对大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的脑炎情况下小鼠骨髓源性单核细胞(bonemarrowderivedmonocytes,bmdm)向脑内迁徙的规律和特点进行初步观察。方法:将构建的融合了人igg1引导序列、人源化抗-tat单链抗体hutat2、人igg3fc段的重组基因片段(hutat2:fc)连入tat基因敲除的转移质粒骨架phr-hb7-ires-egfp,与pcmv-Δr8.2、pcmv-vsv-g共转染293t细胞制备重组慢病毒载体hr-hutat2。用重组慢病毒载体分别转导人神经细胞系htb-11、单核细胞系u937和hmdm,通过免疫荧光染色、qrt-pcr、westernblot法和elisa检测细胞重组融合蛋白hutat2:fc的表达和分泌。通过免疫斑点结合实验和westernblot法体外检测hutat2:fc与tat的结合作用,通过细胞活力和细胞相对存活率检测评价hutat2:fc对tat诱导的htb-11和原代小鼠皮质神经元毒性的保护作用,通过p24定量来评价hutat2:fc对hiv-1感染的hmdm的病毒抑制作用。通过对细胞形态学、细胞生长动力学、qrt-pcr对15个hmdm功能相关基因表达的检测,及对hmdm分泌的il1β、il8、il10和tnf-α的检测来评价慢病毒基因转导的潜在的副作用。用lps小鼠脑炎模型评价经鼠尾静脉输注的超顺磁性氧化铁(superparamagneticironoxide,spio)标记的外源性小鼠bmdm和gfp转基因小鼠bmdm向中枢神经系统迁徙的特点和分布规律。结果:慢病毒载体可高效转导实验细胞系和hmdm(转导效率分别为99%,95%和53%)。转导的细胞可长期、稳定的表达目的蛋白。在细胞内和细胞培养上清液中均可检测到正确形式的hutat2:fc融合蛋白,hutat2:fc融合蛋白可在细胞培养上清液中累积至高浓度。hutat2:fc可体外结合hiv-1tat,拮抗tat对htb-11细胞系和原代小鼠皮质神经元的毒性作用。分泌的hutat2:fc和hr-hutat2转导的hmdm可显著抑制hiv-1bal感染的人巨噬细胞p24的表达及hiv-1诱导的细胞病变效应。慢病毒载体介导的基因转导对细胞形态学和细胞活力无显著影响。15个检测基因中,转导的hmdm的il8、stat1和ido1基因表达上调,但并未观察到这些基因表达上调对hutat2:fc的神经保护作用的影响。体外培养的小鼠bmdm细胞可迁徙入lps诱导的脑炎小鼠患侧大脑,在移植后第2天数目达到高峰,随后逐渐聚集在炎性部位周围,进入脑内的单核细胞数目随脑内炎症的消散而逐渐减少。结论:慢病毒载体介导的基因转导可有效的将目的基因导入人细胞系和hmdm,且不引起hmdm明显的免疫激活。受试人类细胞系和原代hmdm表达的hutat2:fc融合蛋白具有与完全tat单克隆抗体相似的神经保护和抑制hiv复制的效果。小鼠bmdm可在脑内炎症情况下迁徙入大脑并聚集在患侧炎性部位周围。本研究为利用以Hutat2:Fc为工具的、以单核/巨噬细胞为基因运载工具的HAND的基因治疗奠定了理论和实验基础。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.91;R749.1
【图文】：

示意图,巨噬细胞,单核,神经细胞

1. HIV 感染的单核/巨噬细胞迁徙入脑并引起神经细胞损失示意图[80]。（1）已 T 细胞直接接触星状细胞，通过病毒突触感染星状细胞；（2）感染星状细胞后，因组形成潜伏感染；（3）HIV 感染的单核/巨噬细胞在感染早期即可进入大脑，继血管旁巨噬细胞和小胶质细胞播散；（4）HIV 感染的星状细胞、小胶质细胞等细毒毒性蛋白（Tat 和 gp120）和前炎性细胞因子和趋化因子造成神经细胞损伤；（系统内 HIV 持续低水平的复制促进慢性活化的 T 细胞入脑，通过释放前炎性细胞神经元损伤。在HAND的发病机制中，Tat的神经毒性作用最为广泛。Tat是一个保守的子蛋白，是 HIV-1 转录关键的反式激活因子，也是 HIV 感染后最先表达。常用的抗病毒药物的靶点是 HIV 蛋白酶或逆转录酶，对 HIV 早期病毒蛋Nef 均无拮抗作用 [12, 80]。即使控制了病毒复制，受感染巨噬细胞及不断产生并释放 Tat 至细胞外，脑外的 Tat 也可透过 BBB 进入 CNS，脑内神经轴索运输最终引起神经远程损害 [84]。近年来关于 Tat 在 HAND 发

结构示意图,融合蛋白,单链抗体,多聚

图 2. 慢病毒载体构建相关质粒结构示意图。以 HIV-1 为基础的慢病毒载体通过三质粒系统共转染 HEK 293T 细胞获得。制备的两种慢病毒载体分别表达治疗性抗 HIV-1 Tat 单链抗体Hutat2:Fc 融合蛋白（HR-Hutat2）或阴性对照抗 EBV LMP-1 单链抗体 A3H5:Fc 融合蛋白（HR-A3H5）；融合蛋白融合了人 IgG1 引导序列以指导蛋白向内质网的表达，同时融合了人IgG3 Fc 结构域以增强其稳定性和标记蛋白产物。LTR: 长末端重复；ψ: 包装信号；SD: 剪接供体；SA: 剪接受体；CMV：巨细胞病毒启动子；scFv:Fc：编码抗 Tat Hutat2:Fc 或抗 EBV LMP-A3H5:Fc 融合蛋白的结构；Fc：人 IgG1 铰链区和 IgG3 Fc 结构域；IRES：内部核糖体进入位点；EGFP：增强绿色荧光蛋白；gag、pol、vif、vpu、rev、tat、nef：HIV-1 相关蛋白；Insulinp（A）：胰岛素多聚（A）尾巴；VSV-G：水疱性口炎病毒 G 蛋白；SV40 poly（A）：猴空泡病毒 40 多聚（A）尾巴。2) 钙磷沉淀法转染 293T 细胞[241, 242]A HEK 293T 细胞培养在 DMEM-10%FBS 培养基中。转染前一天将培养的 HEK293T 细胞按 1:4-1:5 比例传代接种至 T75 培养瓶中，使其分散均匀，次日应

质粒,酶切电泳,特异性引物,实验组

andard error means，s.e.m）。独立样本间显著性差异采用 Student’s t-检3 个或 3 个以上实验组间统计学意义采用 One-way ANOVA 和 Tuke hoc 检验。各实验组与对照组的比较采用 Dunnett 检验。P 值为双尾统计学显著差异。结果转移质粒的构建与鉴定合成抗 HIV-1-Tat Hutat2:Fc 和抗 EBV LMP-1A3H5:Fc 的 DNA 片段质粒骨架 pHR-cPPT-CMV-IRES-EGFP-SIN，得到相应的转移质粒 pH组转移质粒 pHR-A3H5。质粒转化感染态细胞后，小提质粒，经 Bam、1%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定（图 3A），以及 PCR 扩增确定插入正确（图 3B）。随后进行下一步细菌培养、大提质粒获得相应质粒实验所需的包装质粒 pCMV-△R8.2 和包膜质粒 pCMV-VSV-G。

【共引文献】