LAMP-2在原发性胆汁性肝硬化中的临床意义及其参与胆汁排泄的机制探讨

发布时间：2020-08-20 08:32

【摘要】：原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一种慢性进行性肝内胆汁淤积性肝病,最终可发展为肝纤维化和肝硬化。PBC在世界各地均有分布,各年龄段均可发病,尤其好发于中年女性。西方国家报道的发病率较高。近年来,由于对PBC认识程度和疾病诊断水平的提高,我国报道的PBC病例数也呈大幅度上升趋势。熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)是美国食品药品监督管理局(food and drug administration,FDA)批准的目前可用于PBC治疗的唯一药物。研究发现长期使用UDCA可有效改善患者的各项指标,延缓疾病进展,减少肝硬化发生,降低肝移植需求率,提高患者的生存率。但仍有约1/3的患者对UDCA不应答,40岁的PBC患者不应答率甚至超过50%。因此,早期发现那些UDCA不应答或部分应答的PBC患者具有重要的临床意义。溶酶体相关膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2,LAMP-2)是我们率先发现的PBC相关分子,前期研究发现LAMP-2对PBC病理诊断具有重要意义,且其在PBC肝脏组织中的表达与疾病病理分期正相关。但LAMP-2分子的确切功能尚待深入研究,尤其是其在PBC等胆汁淤积性疾病中的作用目前还不清楚。本研究共分三部分:1)鉴于肝穿病理检查的局限性和有创性,从血清学角度出发,利用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测PBC患者血清中的LAMP-2含量,进一步结合患者临床相关指标的变化,分析血清LAMP-2在PBC临床中的意义,尤其是其对PBC患者UDCA生化应答的评估价值。2)为了深入了解LAMP-2分子在PBC等胆汁淤积性疾病中的作用,借助转录激活因子样效应核酸酶技术(transcription activator-like effector nucleases,TALENs),构建LAMP-2基因敲除大鼠模型,并对该模型鼠的胆汁淤积表型进行鉴定。3)以所建的LAMP-2基因敲除大鼠模型为工具,探讨LAMP-2与肝细胞胆汁淤积的关系,以及LAMP-2参与肝细胞胆汁排泄的可能机制。第一部分应用血清LAMP-2评价PBC患者UDCA应答的临床研究【目的】UDCA是美国FDA批准的目前可用于PBC治疗的唯一药物。研究发现长期使用UDCA可有效改善患者的各项指标,延缓疾病进展,减少肝硬化发生,降低肝移植需求率,提高患者的生存率,但仍有约1/3的患者对UDCA不应答。我们前期研究发现LAMP-2在PBC患者肝脏组织中的表达与患者疾病病理分期正相关。本研究拟在前期研究基础上探讨PBC患者血清LAMP-2水平与疾病进展之间的关系,尤其是血清LAMP-2在评估患者UDCA生化应答方面的价值。【方法】该回顾性研究纳入了自2007年至2013年就诊于我院(第四军医大学,西京消化病医院)的新诊断PBC患者102例。所有患者均接受UDCA治疗,治疗剂量为13~15 mg/kg/day。采集患者治疗前和治疗后1、3、6和12个月时的全血标本,收集血清。同时收集相应时间点的随访资料,其中包括肝穿病理检查结果和临床相关检测指标,如总胆红素、ALP、GGT、AST、ALT、ALB和Ig M等。研究同时纳入了经由我院诊断的乙肝患者126例、丙肝患者114例,肝内胆汁淤积患者(包括自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、药物性肝病、Gilbert's病和Dubin-Johnson综合征)27例,以及未发现明显异常的健康对照者84例。各对照组年龄和性别均与PBC患者保持组内平衡。所有对照者均收集有治疗前的血清标本,以及相应时间点的随访资料。利用ELISA方法检测PBC患者及对照者血清中的LAMP-2含量,进一步分析血清LAMP-2在PBC临床中的意义。【结果】1)治疗前PBC患者血清LAMP-2水平明显高于乙肝患者、丙肝患者、肝内胆汁淤积患者以及健康对照者。2)治疗前不同PBC亚群患者血清LAMP-2水平不同,其中以晚期患者(III-IV期)和胆红素1mg/d L的患者血清LAMP-2升高最明显。3)治疗前PBC患者血清LAMP-2水平不能独立反映UDCA疗效。4)PBC患者接受UDCA治疗后,血清LAMP-2降低趋势与肝脏相关指标的变化趋势一致,并在UDCA治疗3个月时降低即很明显。5)PBC患者接受UDCA治疗后,应答患者血清LAMP-2降低更明显。6)UDCA治疗3个月时,PBC患者血清LAMP-2下降有助于患者UDCA应答的判读。【结论】PBC患者接受UDCA治疗3个月时,血清LAMP-2的下降有助于评判患者对UDCA的应答。第二和三部分LAMP-2参与肝细胞胆汁排泄的机制研究【目的】LAMP-2分子在多种生物学进程中发挥重要作用,但该分子的确切功能尚待深入探讨。我们前期研究发现,PBC患者肝脏组织中LAMP-2表达与患者疾病进展密切相关,血清LAMP-2变化对评判PBC患者UDCA生化应答具有重要价值。本部分的研究目的在于探讨LAMP-2在胆汁淤积性疾病中的作用,以及LAMP-2参与肝细胞胆汁排泄的可能机制。【方法】利用TALENs技术构建LAMP-2基因敲除大鼠模型,并以建立的基因敲除大鼠模型为工具,通过体内研究探讨LAMP-2与肝细胞胆汁淤积的关系,以及LAMP-2参与肝细胞胆汁排泄的可能机制。体外构建LAMP-2过表达及LAMP-2 RNAi干扰细胞模型,并以所建细胞模型为工具,对体内研究结果进行验证。【结果】借助TALENs技术,成功构建了LAMP-2基因敲除大鼠模型。进一步研究发现:1)LAMP-2基因敲除大鼠肝脏表现有胆汁淤积的现象。2)LAMP-2基因敲除大鼠对胆汁淤积的耐受性降低,更易发生胆汁排泄障碍。3)相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)差异分析结果显示,LAMP-2基因敲除大鼠肝细胞毛细胆管膜转运体异常改变。4)LAMP-2基因敲除大鼠肝脏毛细胆管膜上与胆汁排泄直接相关的重要转运体多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,Mrp2)表达异常。5)LAMP-2基因敲除大鼠的体内实验发现,LAMP-2通过调控Mrp2在肝细胞毛细胆管膜上的定位,影响肝细胞胆汁排泄过程。6)体外细胞学实验支持:LAMP-2参与调控MRP2在肝细胞毛细胆管膜上的定位,进而可能参与肝细胞毛细胆管膜的形成,从而影响肝细胞胆汁排泄过程。【结论】LAMP-2分子通过调控Mrp2/MRP2分子在肝细胞毛细胆管膜上的定位,参与影响肝细胞毛细胆管膜的形成,最终影响肝细胞的胆汁排泄能力。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.22
【图文】：

受损胆管周围可见由上皮样组织细胞和多核巨噬细胞形成的肿的特点是组织细胞胞质内有大量泡沫细胞，因此又称脂质（黄色瘤病变常使汇管区扩大，淋巴细胞弥散侵入肝小叶，形同碎屑样坏死。细胞破坏胆管基底膜形成的、含有增生胆管和肉芽肿的碎屑样坏死称样坏死，有别于自身免疫性肝炎的淋巴细胞性碎屑样坏死[22, 23]。dwing 等[24]根据 PBC 患者胆管损伤、炎症和纤维化的程度，将该病的变分为四期（图 1）：Ⅰ期（门管期），以汇管区炎症为特征伴或不伴花，炎症局限于汇管区。Ⅱ期（门管周围期），以汇管区周围的损害逐渐肝实质，称为界面性肝炎。汇管区周围损害局部不规则，以细胞坏死被炎症细胞及巨噬细胞分隔为特征，形成胆汁性碎屑样坏死。Ⅲ期（间架扭曲变形为特征，伴有较多的纤维性隔膜形成，多数病例胆管数量期（硬化期），表现为正常肝小叶结构破坏，假小叶形成。值得注意的不均一，四个阶段的病理特征可同时出现于同一块组织中[19, 25]。

体产生的AMA均可识别大肠杆菌PDC-E2和OGDC-E2肽段，提示病原体可能表达与自身抗原相似的抗原表位，刺激机体产生抗自身抗体，引发交叉免疫反应，成为PBC发病的触发因素（图2）[63]。微生物通过分子模拟机制诱发PBC的理论可以归纳为：（1）微生物的CpG模体可以刺激PBC患者外周血中的CD27+记忆性B细胞产生IgM，并且该记忆性B细胞产生IgM的现象是通过Toll样受体-9 （Toll-like receptor 9，TLR 9）信号通路实现的。（2）CpG可以刺激PBC患者的B细胞产生AMA，过表达TLR 9、CD86分子，增强钾通道KCa3.1活性。（3）CpG诱导的AMA分泌和TLR 9、CD86上调，都可以被钾通道KCa3.1的特异性抑制剂TRAM所抑制。这些证据也提示：PBC患者的B细胞免疫依赖于增强的固有免疫反应，并且TRAM-34可以影响PBC患者体内的B细胞自身免疫反应[66]。另一类抗原模拟物主要来自细胞外异生物质，这些外来化合物可以通过结合或修饰作用

值得重视的是，这些研究证据均支持：凋亡过程中细胞类型的特异性差异以及对凋亡细胞的吞噬作用，是PBC患者特异性组织损伤的原因。目前研究认为以下三种机制可能参与了PBC患者BECs的损伤（图3）：①杀伤性T细胞识别BECs表面MHC分子递呈的PDC衍生抗原，从而造成对BECs杀伤；或自身抗体与BECs表面的PDC/PDC相关蛋白发生交叉反应，通过抗体依赖的细胞毒作用，激活NK细胞或其他效应细胞，触发对BECs的破坏。②在胆汁酸盐的刺激下，碳酸氢盐转运体AE2 等表达下调，使得BECs失去了“碳酸氢盐保护伞”的保护，进而诱导BECs凋亡。③氧化应激等因素触发TGF-β活化，促使BECs发生重塑；或其它因素诱发的BECs衰老或上皮间质转换

本文编号：2797765