miRNAs介导的EZH2调控β-catenin信号在胶质瘤细胞糖代谢过程中的作用和机理

发布时间：2020-08-21 16:03

【摘要】：研究显示Zeste基因同源物增强子2(enhancer ofzeste homolog 2,EZH2)是果蝇zeste基因增强子的人类同源物,属于PcG(Polycomb group)蛋白家族,为表观遗传蛋白调控因子PcG的核心成分之一,具有组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性。众多研究显示EZH2在乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用。我们的前期工作中已经发现EZH2在胶质瘤中高表达,且与胶质瘤预后相关,提示EZH2在胶质瘤中是潜在促癌分子,但其具体功能及相关机制有待阐明。代谢调控是人体生命活动的基本问题,其状态异常与多种重大疾病的发生发展密切相关。“细胞能量异常(Deregulating Cellular Energetics)”是肿瘤细胞的特征之一。胶质瘤发生于神经外胚层,来源于神经胶质细胞,是具有高度异质性的原发颅内肿瘤,具有发病率高、复发率高、病死率高的特点。中枢神经系统以葡萄糖为唯一能源,因此胞内能量代谢产物及代谢过程的变化尤其是糖代谢异常与胶质瘤的发生发展关系密切,探索胶质瘤细胞糖代谢异常的分子机制对胶质瘤的诊断治疗相关研究具有重要意义。在本课题第一部分中,我们首先借助中国胶质瘤协作组(CGGA)数据库,分析PcG相关基因在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达情况,并在获得的结果基础上逐步细化差异表达基因与胶质瘤组织级别的相关性,同时关注EZH2与患者生存预后的关系;随后,分别使用RNA干扰手段和EZH2抑制剂DZNep下调胶质瘤细胞中的EZH2,通过细胞糖酵解水平检测(ECAR实验)评价EZH2对胶质瘤细胞糖代谢功能的影响。结果显示:EZH2下调后,胶质瘤细胞基础糖酵解水平、最大糖酵解能力和糖酵解储备量均明显降低,说明EZH2在有氧糖酵解过程中发挥重要作用。β-catenin信号通路是肿瘤发生演进过程中的经典通路之一,β-catenin已被报道与EZH2存在交互调控关系。为了验证这种交互机制对上述糖代谢过程的影响,我们引入β-catenin的小分子抑制剂FH535处理胶质瘤细胞,发现β-catenin活性抑制后胶质瘤细胞基础糖酵解水平、最大糖酵解能力和糖酵解储备量均明显降低,说明β-catenin能够影响胶质瘤代谢,这为ezh2的糖代谢调节功能提供了一个可能的效应出口。微小rna(micrornas,mirna)近10年来始终是肿瘤研究领域的热点。mirna的信号传递体系包括多种形式,其本身接受上游转录调控分子信号,向下游则可通过识别特定的目标mrna的3'端非编码区域(3'-untranslatedregion,3'-utr),在转录后水平通过促进靶mrna的降解和/或抑制翻译过程而发挥调控基因表达。随着系统生物学研究的开展,mirna的研究也从单一功能走向整体综合的水平。大量报道证实mirna表达谱特征与肿瘤的诊断、分期、进展、预后及治疗效果存在相关性,是肿瘤基因调控网络中的重要枢纽分子。作为转录抑制因子,ezh2可沉默下游诸多靶基因,而mirna也是一大类可被ezh2调控的靶向分子。在本课题第二部分中,我们同样使用sirna和dnzep两种处理方法,分别借助mirna表达谱芯片技术筛选ezh2相关mirna差异谱。结果显示,胶质瘤细胞使用si-ezh2处理后有204种mirna表达上调,59种下调,而使用dnzep处理后有206种mirna上调,22种下调,取两者交集为ezh2相关的靶mirna谱,获得以mir-328、mir-1224-3p和mir-214为代表的85种呈均一趋势显著上调的mirna。结合生物信息学靶点预测,我们构建了β-catenin3’-utr区潜在结合位点的荧光素酶报告基因质粒,双报告基因检测验证β-catenin确实为mir-328、mir-1224-3p和mir-214的直接靶基因,提示mir-328、mir-1224-3p和mir-214可介导ezh2对β-catenin的调控作用。之后,在cgga数据库同时进行mrna芯片和mirna芯片检测的胶质瘤组织样本数据中,我们分析发现ezh2与mir-328表达呈现显著的负相关关系,而与mir-1224-3p和mir-214的关联性并不显著。因此,我们决定选择以mir-328为例进一步探索mirna介导的ezh2作用机制。表观遗传学指在不改变dna序列的前提下,通过某些机制引起可遗传的基因表达或细胞表型变化。近年来研究者们逐渐意识到表观遗传变异对肿瘤的发生、发展、转移和预后能够产生重大影响,研究发现DNA甲基化状态异常等在胶质瘤的发生发展过程中发挥重要的调控作用。目前在胶质瘤中已经发现DNA甲基化可以导致细胞周期、凋亡、DNA损伤修复等过程的多种相关基因表达沉默。EZH2是多梳抑制复合体2(Polycomb repressive complex,PRC2)的核心催化组分,可通过其高度保守的SET区域对核小体组蛋白H3K27进行甲基化。约50%的miRNA基因与CpG岛有关,其可能被表观遗传甲基化抑制。本课题第三部分应用亚硫酸盐处理后测序法检测miR-328启动子区甲基化水平,结果显示EZH2下调后miR-328启动子区甲基化水平明显受抑,随后结合染色质免疫共沉淀实验(CHIP)证实了EZH2与miR-328启动区的结合位点。最后,为了进一步验证EZH2对胶质瘤细胞糖代谢的影响是通过miR-328介导所实现的,我们设计了相应的回复实验。在对照组和si-EZH2转染组基础上增加si-EZH2+si-miR-328组,将si-EZH2与si-miR-328共转入细胞,EACR实验显示共转组中ECAR比si-EZH2转染组出现回复效应,且si-EZH2引起的β-catenin表达下降可被si-miR-328回复,说明si-miR-328可逆转si-EZH2对胶质瘤细胞糖代谢的抑制作用,再次证明miR-328是EZH2糖代谢调控作用的中介分子。综上所述,本课题综合运用细胞功能检测(ECAR)、高通量筛选(mi RNA芯片)、miRNA/mRNA互作检测(荧光素酶报告基因)、染色质蛋白互作检测(CHIP)、表观遗传学DNA甲基化分析(MSP)等方法,对胶质瘤细胞中EZH2的功能及机制进行了系列探索。研究发现EZH2能够调节胶质瘤细胞糖酵解水平,获得了胶质瘤细胞中的EZH2相关mi RNA分子谱,并在胶质瘤细胞中完成了EZH2/miR-328/β-catenin通路的实验构建。这些结果为后续深入研究miRNA介导下的EZH2调控分子网络奠定了基础,也为寻找胶质瘤诊断和预后评估的生物靶点和探索胶质瘤发生和演进机制并优化治疗策略提供了理论参考。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41

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