脂肪干细胞生物学特性及参与脊髓损伤修复研究
发布时间：2020-08-22 22:27
【摘要】：第一章 小鼠脂肪干细胞生物学特性研究背景：干细胞研究在世界范围内掀起了一股热潮,因干细胞具有增殖与分化的特性,所以受到越来越多研究者的关注。在诸多成体干细胞的研究中,脂肪干细胞由于其独特的优势,在组织工程学领域逐渐突显出来。目的：通过体外分离培养获得小鼠脂肪干细胞系,了解其生物学特性,并为后续研究提供实验材料。方法：以15只成年昆明系小鼠腹部皮下及腹股沟处脂肪组织为材料,Ⅰ型胶原酶37℃条件下消化1h获得脂肪干细胞。筛选培养体系对脂肪干细胞进行体外培养,应用免疫组化鉴定小鼠脂肪干细胞表面标志物,分析小鼠脂肪干细胞体外扩增情况,分析脂肪干细胞在体外培养时的染色体核型变化。结果：15只成年昆明系小鼠,分离获得12个小鼠脂肪干细胞珠,原代细胞开始培养时,细胞短小,呈圆形或卵圆形,胞体折光度高,24小时后可见培养板有少量细胞贴壁,48小时后贴壁细胞数量大大增多,待长满培养板趋于融合时,细胞变得细长呈纺锤形,形态为长梭形。经过120天的培养并对细胞生长情况进行记录,发现小鼠脂肪干细胞的生长曲线呈典型的“S”型,PDT分别为42.14hr,46.32hr和43.34hr。细胞增殖过程经历了潜伏期、对数生长期和平台期,说明小鼠脂肪干细胞具有较强的自我更新能力,易于进行体外扩增培养。在体外长期培养时,小鼠脂肪干细胞的衰老水平很低,在25代以内基本没有明显衰老现象；在传至30代时,只有不到5%的细胞表现出衰老现象,传至35代时也仅有不到15%的细胞表现出衰老现象。脂肪干细胞进行免疫组化鉴定：显示CD13, CD29, CD44, CD71, CD73, CD90, CD105和CD166呈阳性表达,MAP-2, GFAP和Nestin呈阴性表达。MAP-2, GFAP和Nestin为神经相关细胞标志物,说明脂肪干细胞不表达神经样细胞相关蛋白。小鼠脂肪干细胞二倍体染色体数目为2n=40,包括19对常染色体和1对性染色体,性染色体为X,Y。结论：本实验所分离的小鼠脂肪干细胞在体外培养条件下扩增能力强,传代后细胞增殖速度快,细胞形态良好,衰老水平很低,且未见向神经系统分化,为后期神经细胞诱导和脊髓损伤修复提供了宝贵实验材料。第二章 小鼠脂肪干细胞诱导分化为神经样细胞的研究背景：之前相关的研究认为,神经细胞在神经系统内产生后,很短的时间内就不会在产生新的神经细胞。这说明成年动物大脑和脊髓内部的神经细胞是呈现逐渐减少的趋势,这些神经细胞不能够进行再生和自我更新甚至不能够替代。后天出现的神经系统损伤,例如大脑损伤和脊髓损伤,神经系统就不能进行自我替代修复。干细胞来源的神经细胞作为新的神经细胞供体,为神经细胞损伤修复带来新的曙光。目的：通过体外诱导小鼠脂肪干细胞定向分化为神经样细胞,为脊髓损伤细胞治疗提供种子细胞。方法：取第3代培养的小鼠脂肪干细胞,按5×105/mL细胞浓度接种于25 cm2规格的培养瓶中。加入含有20 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF和2% B27的培养基,放置于37℃、5% CO2培养箱中继续进行培养。每隔3天,进行半量更换培养液。于第5-7天时就可以看见有类神经样细胞出现,此时进行免疫荧光染色和RT-PCR鉴定分析nestin。之后对细胞进行吹散、离心,于仅含有2% B27的培养基中继续培养。诱导分化完成后,进行细胞免疫荧光染色及PCR鉴定。结果：小鼠脂肪干细胞在诱导培养第3-4天,细胞开始向中央聚集,第5-7天可见细胞出现许多小突触,细胞开始拉丝能并明显能区分出胞体和突起,免疫荧光染色和RT-PCR分析nestin阳性。于仅含有2% B27的培养基中继续培养第10天开始,部分呈现典型的神经元样改变,细胞呈圆形,内可见明显的细胞核,细胞伸出细长的突起或网状突起。免疫荧光染色和RT-PCR分析可见细胞可以表达MAP-2和GFAPo细胞诱导培养至第14天时直径可达100um。结论：在特定的环境和条件下,小鼠脂肪干细胞可首先分化为神经样细胞,在进一步诱导培养后,可分化成神经元和星形胶质细胞。第三章脂肪干细胞治疗脊髓损伤及疗效评价背景：近年来,各种来源的干细胞已被广泛用于脑、脊髓、周围神经损伤和其他疾病的治疗研究。目前使用干细胞治疗主要问题在于细胞来源,伦理、道德、法律的相关问题,肿瘤的发生、神经性疼痛和免疫排斥反应等不良反应。自体来源的脂肪干细胞因其独特的优势,越来越受到人们的关注。本研究通过使用自体脂肪组织分离的脂肪干细胞定向向神经细胞诱导分化,并将诱导获得的神经细胞注射移植到脊髓损伤小鼠模型内,以期使用自体细胞移植治疗脊髓损伤,为干细胞治疗提供新的理论依据。目的：通过人为制作小鼠脊髓损伤模型,将前期诱导分化好的神经细胞注射移植到损伤模型内,验证小鼠脂肪干细胞诱导分化的神经细胞修复脊髓损伤的能力。方法：首先建立小鼠急性脊髓损伤模型。小鼠用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉。取俯卧位,定位T10节段,将自制塑料垫片((3mm×3mm)置于T10段脊髓硬脊膜。采用改良Allen's打击器,完成一次5g×5cm垂直打击,小鼠尾部痉挛性摆动,双下肢及躯体回缩扑动,示造模成功。其次进行ADSCs的标记。取生长状态良好的ADSCs,加入上述中的诱导液,观察细胞形态发生神经样细胞变化后,利用脂质体包裹携带有GFP报告基因的质转染到诱导后的细胞中。第三ADSCs的移植。脊髓损伤后9d时进行细胞移植治疗。麻醉成功后沿原入路切开各层组织,显露相应损伤脊髓节段,以脊髓损伤区域为中心,实验组用微量注射器移植10μl细胞悬液(1.0×105 cells/μl), PBS对照组注射同体积的PBS,模型对照组不做任何处置。移植完毕后逐层关闭切口。术后常规护理,从移植前1d至结束全程给予环孢霉素A(10 mg/kg/d)注射。移植术后4周时用4%多聚甲醛行心脏灌注固定小鼠,取损伤脊髓节段制作冰冻切片进行检测。结果：4周后对实验组和PBS对照组进行免疫组化检测,实验组的大鼠细胞能够聚集填充脊髓损伤区域,动物脊髓内的神经纤维发生再生,这些神经纤维形成网状与移植的干细胞在脊髓组织内形成交织的网状结构,将脊髓损伤处的两端进行连接。PBS对照组没有出现大量的GFP阳性细胞,脊髓的损伤部位具有较大的空洞,这些空洞呈现囊性。对动物的行为学进行观察可知,实验组动物的后肢运动能力和功能恢复显著好于其他两组。对其进行BBB评分结果可见,实验组小鼠BBB的评分结果显著高于其他两组的动物评分。SPSS对数据进行分析可知,实验组动物干细胞移植后的不同时期与PBS对照和模型对照组比较都具有显著差异,且这些差异有统计学意义(P0.05)。结论：将小鼠脂肪干细胞定向诱导分化为神经细胞移植于脊髓损伤处,能在动物的脊髓损伤部位存活生长,甚至对周围组织能够重建神经环路,最后对机体功能进行重建和完善。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2
【图文】：
呈圆形或卵圆形，胞体折光度高，２４小时后可见培养板有少量细逡逑胞贴壁，４８小时后贴壁细胞数量大大增多，待长满培养板趋于融合时，细胞变逡逑得细长呈纺锥形，形态为长梭形（图２－１）。经过１２０天的培养并对细胞生长情况逡逑进行记录，发现小鼠ＡＤＳＣｓ的生长曲线呈典型的＂Ｓ＂型。从图２－２中可Ｗ看出，逡逑不同代次的ＡＤＳＣｓ的生长曲线均呈典型的＾＂形，ＰＤＴ分别为４２．１４ｈｒ，４６．３２ｈｒ逡逑和４３．３４ｈｒ。细胞增殖过程经历了潜伏期、对数生长期和平台期，说明ＡＤＳＣｓ逡逑具有较强的自我更新能力，易于进行体外扩增培养。说明我们分离的小鼠逡逑ＡＤＳＣｓ具有稳定的生物学特性，符合体外长期培养及后期的研究工作。逡逑W逡逑图２－１体外培养的ＡＤＳＣｓ逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＡＤＳＣｓ逡逑２５逡逑
博壬学位论文逦逡逑１．３．３鼠ＡＤＳＣｓ核型分析逡逑鼠ＡＤＳＣｓ二倍体染色体数目为２ｎ＝４０，包括１９对常染色体和１对性染逡逑色体，性染色体为义Ｙ，雄性为异配ＸＹ，雌性为同配ＸＸ，，染色体大小顺逡逑序及特征见图２－４。这与报道的鼠染色体研究结果基本一致。逡逑
则没有送两种基因的表达。Ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ结果分析可知（如图３－３），随着诱导逡逑时间的延长，神经样细胞标志物也随之X椉樱得鞅臼笛榈挠盏继跫吞逑凳清义匣竦昧顺醪降某晒Αｅ义希牵疲粒绣危危澹螅簦椋铄危停澹颍纾澹溴义襄义
本文编号：2801229
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2
【图文】：
呈圆形或卵圆形，胞体折光度高，２４小时后可见培养板有少量细逡逑胞贴壁，４８小时后贴壁细胞数量大大增多，待长满培养板趋于融合时，细胞变逡逑得细长呈纺锥形，形态为长梭形（图２－１）。经过１２０天的培养并对细胞生长情况逡逑进行记录，发现小鼠ＡＤＳＣｓ的生长曲线呈典型的＂Ｓ＂型。从图２－２中可Ｗ看出，逡逑不同代次的ＡＤＳＣｓ的生长曲线均呈典型的＾＂形，ＰＤＴ分别为４２．１４ｈｒ，４６．３２ｈｒ逡逑和４３．３４ｈｒ。细胞增殖过程经历了潜伏期、对数生长期和平台期，说明ＡＤＳＣｓ逡逑具有较强的自我更新能力，易于进行体外扩增培养。说明我们分离的小鼠逡逑ＡＤＳＣｓ具有稳定的生物学特性，符合体外长期培养及后期的研究工作。逡逑W逡逑图２－１体外培养的ＡＤＳＣｓ逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＡＤＳＣｓ逡逑２５逡逑
博壬学位论文逦逡逑１．３．３鼠ＡＤＳＣｓ核型分析逡逑鼠ＡＤＳＣｓ二倍体染色体数目为２ｎ＝４０，包括１９对常染色体和１对性染逡逑色体，性染色体为义Ｙ，雄性为异配ＸＹ，雌性为同配ＸＸ，，染色体大小顺逡逑序及特征见图２－４。这与报道的鼠染色体研究结果基本一致。逡逑
则没有送两种基因的表达。Ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ结果分析可知（如图３－３），随着诱导逡逑时间的延长，神经样细胞标志物也随之X椉樱得鞅臼笛榈挠盏继跫吞逑凳清义匣竦昧顺醪降某晒Αｅ义希牵疲粒绣危危澹螅簦椋铄危停澹颍纾澹溴义襄义
本文编号：2801229
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