目的：检测WIF1 (Wnt inhibitory factor 1)在正常早孕期绒毛组织、蜕膜组织的表达和定位；研究WIF1在调控人滋养细胞迁移和侵袭中的作用和可能的机制；探讨WIF1在滋养细胞功能调控中的相关信号通路,进一步明确相关分子机制；比较子痫前期和正常胎盘组织中WIF1启动子甲基化状态,探讨WIF1甲基化在子痫前期发病中的可能作用机制。方法：(1)免疫组化和Western blotting (WB)检测人早孕期绒毛和蜕膜组织中WIF1、Wnt5a和P-catenin蛋白的表达。(2)利用慢病毒载体,通过基因过表达和RNA干扰技术,增加和敲除绒毛外滋养细胞HTR8/SVneo和早孕绒毛外植体的WIF1基因表达。(3)采用Western blotting检测干扰效率。(4)采用Western blotting检测Cyclin D1表达,碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色检测细胞周期,MTT实验检测细胞增殖。Annexin V-PE/7-AAD染色检测细胞凋亡。(5)采用Western blotting检测整合素β1、N-cadherin和E-cadherin的表达。(6)Transwell小室和Matrigel侵袭实验检测WIF1对HTR8/SVneo细胞迁移和侵袭能力的调控。(7)明胶酶谱法检测HTR8/SVneo细胞的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的活性,Western blotting检测基质金属蛋白酶组织抑制齐(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)蛋白表达水平。(8)Western blotting检测WIF1对β-catenin和Wnt5a的表达影响。(9)免疫共沉淀检测WIF1与Wnt3a和Wnt5a的作用。(10)用重组Wnt5a蛋白培养HTR8/SVneo,采用Western blotting检测β-catenin、整合素β1、α5和N-cadherin的表达。(11)激光共聚焦显微镜检测重组Wnt5a对滋养细胞钙离子浓度的影响,进一步明确WIF1调控滋养细胞功能的相关信号通路。(12)运用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR, MSP)定性分析和亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR, BSP)定量检测比较WIF1在子痫前期和正常胎盘组织中的甲基化状态,Western blotting检测DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMTs)的表达,甲基化抑制剂处理滋养细胞后检测WIF1的表达,探讨WIF1甲基化在子痫前期发病中的作用及可能机制。结果：(1)WIF1和Wnt5a在合体滋养细胞(syncytiotrophoblast, STB)、滋养细胞柱(trophoblast column, TC)及细胞滋养细胞(cytotrophoblast, CTB)胞浆中均有较高表达；β-catenin在STB、TC及CTB胞浆中均表达,但在CTB中的表达高于其他细胞。WIF1和Wnt5a在母体蜕膜CTB及腺上皮、间质细胞中亦有表达。β-catenin在蜕膜CTB中的表达要高于母体蜕膜细胞。WIF1和Wnt5a在蜕膜组织中的总体蛋白水平高于绒毛组织,而β-catenin在蜕膜中的的总体蛋白水平低于绒毛组织。(2)WIF1促进HTR8/SVneo细胞增殖和凋亡。(3)过表达WIF1抑制HTR8/SVneo细胞和绒毛外植体整合素β1和E-cadherin的表达,促进HTR8/SVneo细胞N-cadherin的表达。(4)过表达WIF1可以通过增加MMPs的活性、抑制TIMPs的表达来促进绒毛外滋养细胞迁移和侵袭能力。(5)WIF1在HTR8/SVneo细胞中直接和Wnt3a和Wnt5a结合,激活β-catenin,促进Wnt5a的表达。(6)重组Wnt5a抑制HTR8/SVneo细胞整合素β1、α5和N-cadherin的表达。(7)重组Wnt5a激活滋养细胞中的钙信号。(8)WIF1在子痫前期的胎盘组织和正常早期、晚孕期胎盘组织中均有甲基化,但甲基化程度不高,正常足月胎盘组织的甲基化程度比子痫前期的足月胎盘组织和正常早期胎盘组织稍高,但差异并无统计学意义。(9)WIF1的蛋白在子痫前期胎盘组织中的表达存在个体差异,总体水平低于正常胎盘组织,但无显著性差异。(10)DNMTs在子痫前期胎盘组织中表达均显著降低。(11)甲基化抑制剂可以显著提高滋养细胞株JEG3和HTR8/SVneo的WIF1的表达,说明WIF1的表达受甲基化调控。结论：(1)WIF1通过调控MMPs的活性和整合素、钙黏蛋白和TIMPs的表达影响滋养细胞的侵袭能力,是胎盘发育过程中的重要调控因子(2)WIF1在滋养细胞中可以激活P-catenin信号,并与Wnt5a相互作用,后者可抑制HTR8/SVneo细胞β-catenin、整合素β1、α5和N-cadherin的表达,说明Wnt信号通路在滋养细胞侵袭中的调控作用。(3) WIF1的表达受甲基化调控。子痫前期胎盘组织中DNMTs表达均显著降低,WIF1甲基化水平和蛋白表达与正常组织无明显差异。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R714.244
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9 董e
本文编号：2816147
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