MMPs在兔腹主动脉AS斑块内血管新生中的作用及通络干预的研究

发布时间：2020-09-17 15:05

　　背景：动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)中不稳定斑块破裂从而引发血栓的形成逐渐成为急性心血管事件的首要病因。因此,稳定易损斑块具有极为重要的临床意义。病理学研究结果表明,不稳定、易破裂的动脉粥样硬化斑块具有如下特征：持续性的炎症反应,基质降解,以及细胞死亡。这些改变最终导致纤维帽变薄,炎症增多,坏死核心增大。斑块内新生血管是动脉粥样硬化斑块的另一重要特征。随着斑块的进展,新生血管数量及密度逐渐增多；在晚期斑块中,脂质、炎细胞等持续通过新生血管进入斑块内部的主要通道,斑块易损性随着新生血管数量的增多而增大。斑块内新生血管因缺乏完整地基底膜和其他结缔组织,因此具有脆性较大、渗透性较高等特点,导致红细胞及血液中的脂蛋白极易渗漏至斑块内,加重斑块内脂质的形成,导致动脉粥样硬化斑块的硬度降低,亦可引起炎症细胞渗漏增多,从而增加了斑块的不稳定性。在多种因素的共同作用下,引发斑块内出血以及斑块破裂。异常的斑块内膜及中膜血管新生被视为易损斑块的标志之一。血管新生受多种诱导因子和抑制因子的复杂调控,其中涉及多条信号转导通路参与斑块内血管新生。血管新生依赖细胞及细胞外基质的相互作用,细胞外的蛋白水解是血管新生所必需的。因此,在血管新生中,蛋白酶是必不可少的部分,其可促使细胞外基质(ECM)降解,促进内皮细胞迁移及新生血管的形成。基质金属蛋白酶(MMPs)在内皮细胞迁移和管腔形成过程中可直接降解细胞外基质成分,故受到越来越多的重视。基质金属蛋白酶,是一类能够降解细胞外基质成分的锌依赖性内肽酶家族。目前发现的20多种MMP家族成员根据其结构和作用底物的特异性可分为四大类：间质胶原酶(MMP-1、-8、-13及-18)、明胶酶(MMP-2及-9)、间质溶解素(MMP-3、-10及-11)和膜型基质金属蛋白酶(MMP-14及-15)。越来越多的研究结果表明,在血管新生过程中,基质金属蛋白酶不仅参与降解细胞外基质,亦可通过多种其他途径调节该过程。MMP-1、-2、-3、-9可促进血管新生,部分MMPs也可抑制血管新生。然而,MMPs在AS进展期斑块内血管新生中的主要作用仍不明确,有待进一步研究。目的：1.建立与人类AS病变特征类似的动物模型,观察兔动脉粥样硬化斑块进展期各MMPs表达的变化趋势；2.阐明各MMPs在AS进展期对斑块内血管新生及其易损性的影响及可能的作用机制。方法：1.建立动物模型纯种新西兰雄性大白兔(体重1.7-2.1kg)27只给予球囊拉伤术损伤腹主动脉后,高脂饲料(1%胆固醇)喂养。分别在术后4、6、8、10和12周末随机选取5只实验兔给予安乐死。2.血液生化指标的检测各实验兔分别于4、6、8、10和12周末处死前留取自凝血,用作生化指标的测定。禁食12h,称取体重后,经其耳缘静脉留取自凝血,采用酶法检测血清中甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)以及总胆固醇(total cholesterol, TC)的浓度。3.AS易损斑块的影像学特征检查于4、6、8、10和12周末处死动物前应用血管内超声(IVUS)测量血管外膜弹力膜面积(the external elastic membrane area, EEMA)、管腔面积(lumen area,LA)、斑块面积(plaque area, PA)及斑块负荷(the percentage of plaque burden, PB)等指标。4.组织病理学染色在相应时间点麻醉动物后,开胸,剪开右心耳,给予生理盐水灌注。待血液冲洗干净后,留取球囊损伤处腹主动脉标本,组织脱水,浸蜡切片。制备厚度为5μm的石蜡切片进行常规苏木素-伊红(HE)染色,同时进行油红O染色和天狼猩红染色使脂质及胶原显色。5.免疫组织化学染色用腹主动脉石蜡切片进行免疫组织化学染色检查,用RAM-11和a-actin抗体测定斑块中巨噬细胞及平滑肌细胞的表达分布情况；应用MMP-1、-2、-3、-9及-14抗体检测各MMPs在斑块内的表达水平；应用Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)及Ⅲ型胶原(COL-Ⅲ)抗体检测斑块内胶原含量；应用VEGF抗体检测斑块内VEGF表达水平。测量血管内膜-中层厚度(intima-media thickness, IMT)。图片分析使用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统。6.毛细血管密度测定应用CD31作为血管内皮标记物,测定斑块内微血管的密度。7.蛋白表达水平测定Western Blot):提取腹主动脉的组织蛋白进行蛋白表达水平的测定。提取组织蛋白、凝胶电泳、转膜、孵育一抗、二抗,而后使用化学发光法进行显色。检测组织中MMP-1、-2、-3、-9及-14蛋白表达水平。用IPP图像分析系统进行表达量分析。8.统计学分析所有数据均以均数±校准差表示。组间比较使用单因素方差分析(one-way ANOVA),对数据进行方差齐性检验：若方差不齐,使用Dunnett'S T3法进行检验；若方差齐,则使用LSD法进行检验。同时,应用Spearman秩相关系数分析评价易损指数、微血管密度及VEGF-A与MMPs的相关性。双尾P0.05表示差异有统计学意义。数据均使用SPSS 18.0软件做统计分析。结果：1.实验动物基本情况所有实验兔在球囊损伤后均恢复良好,无并发症出现；实验后期个别实验兔状态较差,分别于术后6周及10周各有1只实验兔死于腹泻。2.实验动物体重的变化随着实验进展,所有实验兔体重均逐步增加,各时间点与上一时间点相比均有统计学差异(P0.05)。3.血液生化指标的检测随着实验进展,实验兔血脂各项指标均逐渐升高。8周组、10周组及12周组中TC、HDL-C和LDL-C与6周组相比均有统计学差异(P0.05),TG则在12周组与6周组相比达到统计学差异(P0.05)。4.血管内超声(IVUS)检查在球囊损伤+高脂饮食后,各组实验兔LA无明显差异(P0.05)；10周组和12周组EEMA. PA及PB均较4周组有显著升高(P0.01),在4周组、6周组及8周组中亦逐渐升高,但无统计学差异(P0.05)。5.病理学检查HE染色显示,血管内膜损伤成功后斑块面积逐渐增大。8周时斑块内出现少量红细胞,提示在球囊损伤腹主动脉内膜后8周左右斑块内开始出现新生血管。油红O染色结果显示,斑块内脂质含量随着斑快面积的增加逐步升高。在12周组中明显高于其他组(P0.01)；10周组与4周组相比,脂质含量也明显增高(P0.05)；4周组、6周组和8周组相比无统计学差异(P0.05)。天狼猩红染色结果显示,4周组、6周组、8周组胶原含量无差异；10周组和12周组中胶原含量明显升高(P0.05)。6.免疫组织化学染色a-actin染色结果显示,平滑肌细胞含量随着实验进展逐步减少。与4周组相比,其余各组平滑肌细胞含量均显著降低(P0.01)；与6周组相比,8周组和10周组平滑肌细胞含量显著降低(P0.01)；与10周组相比,12周组平滑肌细胞含量显著降低(P0.01)；10周组与8周组无统计学差异(P0.05)。RAM-11染色结果显示,斑块内巨噬细胞含量随着斑块的发展逐渐增高。各组与相邻时间组相比均有统计学差异。MMPs染色结果显示,斑块中MMP-1、-2、-3及-9含量随着实验进展均显著升高；而斑块内MMP-14含量则逐渐降低。COL-Ⅰ染色结果显示,斑块中Ⅰ型胶原含量逐渐降低,12周组较4周组Ⅰ型胶原含量降低(P0.05)。斑块中Ⅲ型胶原含量则随着实验进展逐渐增高。VEGF-A染色结果显示,12周组中斑块内VEGF-A含量与4周组相比有所增高(P0.05)。Ⅵ结果显示,随着斑块的发展逐渐升高,其易损性逐渐升高,各组之间的易损性差异均有显著统计学意义(均P0.01)IMT随着斑块的发展逐渐升高,说明血管内膜损伤成功后高脂喂养可引起斑块厚度的逐渐增加,各组IMT与上一组相比均显著升高(均P0.05)。7.毛细血管密度CD31染色结果显示,8周组中斑块内首次观察到新生血管,随后斑块中微血管密度逐渐增加,12周组微血管密度与8周组相比显著增高(P0.05)。8.蛋白表达水平检测(Western Blot)蛋白表达水平检测中,各MMPs出现与免疫组织化学染色中同样的变化趋势：MMP-1、-2、-3及-9蛋白表达量均逐渐升高；MMP-14蛋白表达量则逐渐降低。9.相关性分析Spearman秩相关系数分析结果显示,MMP-1、-2、-3及-9与易损指数呈显著正相关(r值分别为0.767,0.809,0.890,0.887,P0.01)；MMP-1、-2、-3及-9与微血管密度(r值分别为0.762,0.813,0.884,0.769,P0.01)和VEGF-A(r值分别为0.760,0.762,0.858,0.789,P0.01)亦均呈显著正相关；MMP-14则与易损指数、微血管密度及VEGF-A均呈负相关(r值分别为-0.556,-0.424,-0.525,P0.05)；易损指数与微血管密度呈显著正相关(r值为0.846,P0.01)。结论：1.在AS进展期,斑块内MMP-1、-2、-3及-9含量逐渐升高,MMP-14含量逐渐降低；VEGF-A含量逐渐升高；斑块内微血管密度逐渐升高；斑块易损性逐渐增加。2.在AS进展期,斑块内MMP-1、-2、-3、-9上调和MMP-14下调与斑块中微血管密度、斑块易损性及VEGF-A密切相关,说明在AS进展期,MMP-1、-2、-3、-9可能通过上调VEGF-A的表达促进斑块内血管新生,进而导致斑块不稳定。背景：急性心血管事件正在严重威胁人类的健康,其死亡率呈逐年上升趋势,动脉粥样硬化是急性心血管事件的病理学基础,不稳定斑块发破裂从而引发血栓形成日渐成为急性心血管事件的首要病因。AS是一个由多种因素共同参与的病理过程,其发病机制复杂。近年来,因AS的发病广泛且终点事件严重,本病已受到越来越广泛的关注,及早防治势在必行。然而已患病或其他因素引起的AS病人仍普遍存在,且对AS的治疗仍然缺乏有效的措施,故针对其发病机制,应用有效而合理的药物,防止已形成的斑块发展为易损斑块,是预防由AS斑块破裂引起的急性心血管事件的根本原则。大量研究结果表明,斑块内新生血管增多是动脉粥样硬化斑块易损的重要特征之一。在AS斑块中,新生血管因缺乏完整地基底膜和结缔组织,因此新生的血管多渗透性高且脆性大。斑块内新生血管作为脂质持续进入斑块的主要通道,加速红细胞和血液中的脂蛋白易渗出至斑块内,加重斑块内脂质的形成,导致动脉粥样硬化斑块的硬度降低；也可引起炎症细胞渗漏增多,介导炎症细胞的浸润,从而加速了稳定斑块向不稳定斑块的转化。故斑块易损性随着新生血管数量的增多而增大,在多种因素的作用下,发生斑块内出血及斑块破裂。异常的斑块内膜及中膜血管新生被视为易损斑块的标志之一血管新生受多种诱导因子和抑制因子的复杂调控,其中涉及多条信号转导通路。首先血管新生依赖细胞及细胞外基质的相互作用,细胞外蛋白水解可促使基底膜降解,内皮细胞迁移及毛细血管管腔形成。因此,在血管新生中,蛋白酶是必不可少的部分。MMPs作为四类蛋白水解酶中是最为重要的一组蛋白水解酶,也是目前研究最多的,其几乎能降解ECM的所有成分,在内皮细胞迁移和管腔形成过程中可直接降解细胞外基质成分,故越来越受到重视。MMP-2及MMP-9都属于明胶酶,可以降解基底膜胶原及弹性蛋白等,并且具有促使明胶溶解的作用。基底膜的主要成分是具有独特的螺旋结构的Ⅳ型胶原,而多数基质蛋白酶无法降解该胶原。MMP-2及MMP-9因可特异性地降解Ⅳ型胶原,并且可以降解层粘连蛋白等基底膜成分,从而破坏基底膜完整性,因此MMP-2及MMP-9与新生血管的形成关系密切。有研究研究发现,在肿瘤内血管新生中,MMP-2和MMP-9在血管新生中充当“开关”的角色。在前期实验中,通过对新西兰兔腹主动脉AS斑块中MMPs对斑块内血管新生及斑块易损性影响的观察,发现在AS进展期,MMP-2及-9可促进斑块内血管新生,进而导致斑块不稳定。低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein, LRP)是德国学者Herz于1988年发现的一种细胞表面蛋白。近来有研究表明LRP在AS发生发展的多个环节中发挥重要作用,并将其视为AS性疾病的又一新的危险因子。有学者研究发现,在恶性胶质瘤细胞中,LRP1可诱导MMP-2及-9的表达,从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。也有研究发现,LRP1在平滑肌细胞中可上调MMP-2的表达,从而促进平滑肌细胞的迁移。中药具有多途径、多靶点、多环节等特点,可从调节脂质代谢、抑制炎症反应及抗凝等多个方面稳定AS斑块,延缓AS进程。此外,中药制剂药效较为缓和,药物之间通过配伍而起到减毒增效的作用,副作用小,适宜作为长期二级预防用药。通心络是近年来以络病理论为基础、应用通络药物治疗心血管疾病的代表方药。该方具有益气活血,搜风通络之疗效,主要用于治疗冠心病、心绞痛中症属心气不足,血瘀阻络者。多项研究结果表明,通心络具有稳定AS斑块的作用。本研究以阿托伐他汀作为阳性对照药物,应用兔腹主动脉球囊损伤模型,观察通心络对斑块中低密度脂蛋白受体相关蛋白(LDL receptor mlated protein, LRP),磷酸化细胞外信号调节激酶(Phosphorylation-extracellular signal-mgulated kinase, pERK)及MMPs表达的影响,并初步探讨通心络影响斑块中血管新生及斑块易损性的分子机制,为AS的防治提供理论参考。基于以上研究,本课题提出假说：通心络可影响AS斑块内血管新生；通心络可能通过影响LRP1的表达进而影响MMP-2及-9的表达,抑制斑块内新生血管的形成,从而增加斑块稳定性。目的：1.研究通心络在兔腹主动脉AS中对斑块内血管新生及斑块易损性的影响；2.阐明通心络促使斑块稳定可能的作用机制。方法：1.建立动物模型3月龄纯种健康雄性新西兰大白兔(体重1.7-2.1kg)120只,适应性喂养2周,给予球囊拉伤术损伤腹主动脉后,高脂饲料(1%胆固醇)喂养12周。所有动物实验均严格遵守山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的规定和要求。2.动物分组及药物干预成功建立动物模型后随机将动物分为对照组,小、中、大剂量通心络组,阿托伐他汀组以及联合用药组：A组(对照组)：20只,成功建立动物模型后,给予普通饲料喂养12周；B组(小剂量通心络组)：20只,成功建立动物模型后,普通饲料+小剂量通心络(0.15g/kg/d)喂养12周；C组(中剂量通心络组)：20只,成功建立动物模型后,普通饲料+中剂量通心络(0.3g/kg/d)喂养12周；D组(大剂量通心络组)：20只,成功建立动物模型后,普通饲料+大剂量通心络(0.6g/kg/d)喂养12周；E组(阿托伐他汀组)：20只,成功建立动物模型后,普通饲料+大剂量阿托伐他汀(5mg/kg/d)喂养12周；F组(联合用药组)：20只,成功建立动物模型后,普通饲料+大剂量通心络(0.6g/kg/a)+阿托伐他汀(5mg/kg/d)喂养12周。3.血液生化指标的检测各实验兔均处死前留取自凝血,用作血液生化指标的检测。禁食12h左右,称取体重后,经其耳缘静脉留取自凝血,采用酶法检测血清中甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)以及总胆固醇(total cholesterol, TC)的浓度。4.AS易损斑块的影像学特征检查于处死动物前应用血管内超声(IVUS)测量血管外膜弹力膜面积(EEMA)、管腔面积(LA)、斑块面积(PA)、斑块负荷(PB)等指标。5.组织病理学染色在麻醉动物后,开胸,剪开右心耳,给予生理盐水灌注。待血液冲洗干净后,留取球囊损伤处腹主动脉标本,组织脱水,浸蜡切片。制备厚度为5 μm的石蜡切片进行常规苏木素-伊红(HE)染色,同时进行油红O染色和天狼猩红染色使脂质及胶原显色。6.免疫组织化学染色用腹主动脉石蜡切片进行免疫组织化学染色检查,分别应用RAM-11和α-actin抗体测定斑块中巨噬细胞及平滑肌细胞的表达分布情况；应用MMP-2、-9及抗体检测MMPs在斑块内的表达水平；应用LRP1、VEGF-A抗体检测斑块内LRP1、VEGF-A表达水平。测量血管斑块纤维帽厚度及血管内-中膜厚度(IMT),计算纤维帽厚度与IMT的比值。图片分析使用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统。7.毛细血管密度测定应用CD31作为血管内皮标记物,测定斑块内微血管的密度。8.蛋白表达水平测定(Western Blot):提取腹主动脉的组织蛋白检测各蛋白的表达水平。提取组织蛋白、检测蛋白浓度、凝胶电泳、转膜、孵育一抗、二抗,而后使用化学发光法进行显色。检测组织中MMP-2、-9及LRP1等蛋白表达水平。用IPP图像分析系统进行表达量分析。9.统计学分析所有数据均以均数±校准差表示。组间比较使用单因素方差分析(one-way ANOVA),对数据进行方差齐性检验：若方差不齐,使用Dunnett'S T3法进行检验；若方差齐,则使用LSD法进行检验。同时,应用Spearman秩相关系数分析评价易损指数、微血管密度及VEGF-A与MMPs的相关性。双尾P0.05表示差异有统计学意义。数据均使用SPSS 18.0软件做统计分析。结果：1.实验动物基本情况所有实验兔在球囊损伤后均恢复良好,无并发症出现；进入药物干预阶段的实验兔中,中、大剂量通心络组各死亡2只,对照组、小剂量通心络组、阿托伐他汀组及联合用药组各死亡1只,死亡原因分别为呼吸道感染或腹泻。24周末时各组实验动物存活情况如下：A组(对照组)19只,B组(通心络小剂量组)19只,C组(通心络中剂量组)18只,D组(通心络大剂量组)18只,E组(阿托伐他汀组)19只,F组(联合用药组)19只。2.实验动物体重的变化24周末,所有实验兔体重较实验开始前均有所增加,但各组之间相比无统计学差异(P0.05)。3.血液生化指标的检测24周末,与A组相比,其余各组血脂TC、TG及LDL-C含量均有所下降,HDL-C含量则均有所升高：与对照组相比,各药物治疗组血清TC含量均显著降低(P0.01),联合用药组TC含量降低最为显著(P0.01),阿托伐他汀组TC含量较通心络各组明显降低(P0.01),通心络各组随剂量增大降TC效果明显增强(P0.01)；与对照组相比,各药物治疗组血清TG含量均有明显下调(P0.01),联合用药组TG含量下调较为显著(P0.01)；大剂量通心络组与中剂量通心络及阿托伐他汀组TG含量相比均无显著性差异(P0.05),与小剂量通心络组相比则TG含量显著降低(P0.01)；与对照组相比,各药物治疗组血清LDL-C含量均有所下调(P0.01),联合用药组及阿托伐他汀组LDL-C含量降低较为显著(P0.01),二组之间相比LDL-C含量无统计学差异(P0.05)；通心络大剂量组LDL-C水平与通心络小剂量组相比显著降低(P0.01),与中剂量通心络组相比无明显差异(P0.05)；与对照组相比,各药物治疗组血清HDL-C含量均有所升高,大剂量通心络组HDL-C水平明显高于中、小剂量通心络组(P0.05),与阿托伐他汀组相比无显著差异(P0.05)；联合用药组HDL-C含量较大剂量通心络组明显升高(P0.01),与阿托伐他汀组相比则无统计学差异(P0.05)。4.血管内超声(IVUS)检查造模成功并给予药物干预后,与对照组相比,各药物干预组EEMA、PA、 PB均有所降低,各组实验兔LA则无统计学差异(P0.05)：与对照组相比,阿托伐他汀组及联合用药组EEMA显著降低(P0.01),通心络各组EEMA也有所降低,且随着剂量的加大其作用更加显著(P0.01)；与对照组相比,联合用药组及阿托伐他汀组PA、PB下降均较为显著(P0.01)；大、中剂量通心络组PA、PB均有所下降(P0.01),二组之间相比无统计学差异(P0.05)；小剂量通心络组与对照组相比PA、B均无明显变化(P0.05)。5.病理学检查HE染色显示,造模成功后,各组动物腹主动脉斑块明显,与对照组相比,各药物干预组斑块面积有所降低。油红O染色结果显示,药物干预治疗后,各组动物斑块内脂质含量均有所下降,C、D、E、 F组脂质含量显著低于A组(P0.01)天狼猩红染色结果显示,对照组动物腹主动脉斑块内胶原含量显著低于阿托伐他汀组和联合用药组,与各剂量通心络组相比其差异无统计学意义。6.免疫组织化学染色a-actin染色结果显示,与对照组相比,各药物干预组动物腹主动脉斑块内a-actin含量显著升高(P0.05)。RAM-11染色结果显示,与对照组相比,各药物干预组动物腹主动脉斑块内RAM--11含量显著降低(P0.01)。各组腹主动脉斑块内均有LRP1、MMP-2及-9、VEGF-A的局部表达。与对照组相比,各药物组LRP1、MMP-2 及-9阳性表达均显著降低,其中大剂量通心络组、阿托伐他汀组、联合用药组与中、小剂量通心络组相比阳性表达率更低。Ⅵ结果显示,与对照组相比,各药物干预组斑块易损性均显著降低(P0.01),各剂量通心络、阿托伐他汀及联合用药均可降低斑块易损性,中、小剂量通心络组件无显著性差异(P0.05)。与对照组相比,各药物干预组腹主动脉斑块纤维帽厚度显著增高(P0.01)；小剂量通心络组内中膜厚度与对照组相比无统计学差异(P0.05),其余各药物干预组IMT均显著降低(P0.01)；各药物干预组腹主动脉斑块纤维帽厚度/IMT比值与对照组相比均显著升高(P0.01)。7.毛细血管密度CD31染色结果显示,与对照组相比,各药物干预组腹主动脉斑块内微血管密度均显著降低(P0.05)。8.蛋白表达水平检测Western Blot)蛋白表达水平检测中,LRP1、MMP-2、-9出现与免疫组织化学染色中同样的变化趋势：与对照组相比,LRP1、MMP-2、-9及p-ERK蛋白表达量在药物干预组中均显著降低,大剂量通心络组、阿托伐他汀组、联合用药组与中、小剂量通心络组相比阳性表达率更低。9.相关性分析Spearman秩相关系数分析结果显示,LRP1、p-ERK、MMP-2及MMP-9与易损指数呈显著正相关(r值分别为0.568,0.789,0.834,0.638,P0.01)；LRP1、p-ERK、MMP-2、MMP-9与微血管密度(r值分别为0.460,0.469,0.516,0.325,P0.01)及VEGF-A(r值分别为0.492,0.625,0.609,0.496,P0.01)亦均呈显著正相关；易损指数与微血管密度呈显著正相关(r值为0.424,P0.01)。结论：1.通心络超微粉在兔腹主动脉AS中可抑制斑块内血管新生,降低微血管密度降低斑块易损性；2.通心络超微粉在兔腹主动脉AS斑块中可通过抑制LRP1、减少ERK磷酸化、下调MMP-2和-9的表达,从而抑制斑块内的血管新生、促进斑块稳定。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R543.5

【参考文献】