Sonic hedgehog信号通路对正常角质形成细胞增殖及凋亡的影响及其分子机制

发布时间：2017-04-05 04:07

  本文关键词：Sonic hedgehog信号通路对正常角质形成细胞增殖及凋亡的影响及其分子机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：角质形成细胞(keratinocyte,KC)是表皮的主要结构细胞,占表皮细胞的80%以上。KC增殖过度、凋亡不足可导致多种良、恶性皮肤疾病的发生。因此,关于KC增殖与凋亡的调控机制研究始终是皮肤学界关注的重点。越来越多的研究表明,一些高度保守的、调控胚胎发育的信号通路中部分基因突变或异常激活可导致KC的增殖或凋亡异常,其中,Sonic hedgehog(Shh)信号通路在近年来倍受关注。现有资料表明,Shh信号通路能够调控正常的增殖和凋亡,抑制该通路的信号转导能够抑制KC的过度增殖诱导细胞凋亡,但其分子机制尚不清楚。细胞的代谢活动是在动态连贯、复杂有序的信号通路网络的整体调控下完成,因此,系统阐明Shh信号通路调控正常KC增殖与凋亡的分子机制,最首要的任务就是先要明确Shh信号通路究竟通过哪条或哪些信号通路影响KC的增殖和凋亡。大量研究表明,Shh信号通路与胞外信号调节激酶信号通路(extracellular signal-regulated kinase kinase/extracellular signal-regulated kinase,MEK/ERK)信号通路之间存在密切联系,MEK/ERK信号通路广泛存在于真核生物细胞中,是机体细胞增殖、凋亡、分化、迁移等信号调节网络的核心,是很多信号通路的下游通路。我们推测MEK/ERK信号通路在Shh信号通路调控KC的代谢过程中可能具有重要作用。此外,目前公认表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号通路是MEK/ERK信号通路的直接上游通路,大量研究提示Shh信号通路与EGFR信号通路在KC之间的关系也非常密切,如Shh信号通路能够刺激KC产生EGF,同时EGF又可以调节Shh信号通路转录因子Gli-1的表达等,进一步提示MEK/ERK信号通路在Shh信号通路调控KC的生物学行为过程中可能扮演重要角色,目前尚未见类似报道。本课题旨在通过研究,阐释以下问题:①系统阐明Shh信号通路对正常KC增殖及凋亡的影响;②探讨Shh信号通路调控KC增殖及凋亡的分子机制,重点明确Shh信号通路与MEK/ERK信号通路的作用关系,同时观察Shh信号通路对PI3K/AKT和JAK/STAT1/3信号通路的影响;③进一步探讨Shh与EGFR信号通路在正常KC增殖和凋亡调控中的作用关系以及二者对MEK/ERK信号通路的影响。方法:体外培养人正常原代KC、永生化KC系Ha Ca T,采用RT-PCR和western blot检测KC中Shh信号通路关键分子Ptch-1、Gli-1的表达;CCK-8法测定细胞活力;流式细胞术PI标记法检测细胞周期分布,流式细胞术Annexin-V/PI双染法测定细胞凋亡率;采用real time PCR和western blot分别检测目的分子的m RNA转录水平及蛋白表达水平:依次观察特异性调控Shh信号通路对p-ERK1/2、p-AKT、p-STAT1、p-STAT3表达的影响;特异性阻断MEK/ERK信号通路对Shh通路诱导的cyclin D1和Bcl2表达的影响;联合调控Shh通路和EGFR信号通路对Shh诱导的p-ERK1/2、cyclin D1及Bcl2表达的影响。结果:1.Shh信号通路在正常KC中处于开放的活性状态;特异性上调Shh信号通路活性可促进正常KC增殖、抑制凋亡,下调Shh信号通路活性则抑制细胞增殖、诱导凋亡;特异性激活和抑制Shh信号通路活性能够分别促进和抑制KC中cyclin D1和Bcl2的表达。2.在正常KC中,Shh信号通路能够激活MEK/ERK信号通路,而对PI3K/AKT、JAK/STAT1及JAK/STAT3等通路活性无明显影响;MEK/ERK的特异性抑制剂U0126能够阻断Shh信号通路对KC增殖和凋亡的调控,并阻断Shh通路诱导的cyclin D1及Bcl2的表达。3.EFGR信号通路可通过影响Shh信号通路转录因子Gli-1、Gli-2的稳定性及其受体分子(同时也是靶分子)Ptch-1的表达来调节Shh通路活性;联合调控Shh通路和EGFR信号通路可协同诱导ERK1/2的活化和cyclin D1与Bcl2的表达。结论:1.Shh信号通路通过诱导cyclin D1与Bcl2的表达调控正常KC增殖与凋亡。2.Shh信号通路能够激活正常KC中的MEK/ERK信号通路,而对PI3K/AKT、JAK/STAT1及JAK/STAT3等通路活性无明显影响。3.MEK/ERK通路的激活为Shh信号通路调控正常KC增殖与凋亡所必须,Shh信号通路依赖于MEK/ERK信号转导途径调控KC的增殖与凋亡及cyclin D1与Bcl2的表达。4.Shh信号通路与EGFR通路可协同诱导MEK/ERK通路的激活和cyclin D1与Bcl2的表达,且EGFR信号通路对Shh通路活性具有调节作用。综上所述,本研究首次提出并发现MEK/ERK信号通路是Sonic hedgehog信号转导途径调控人正常KC增殖与凋亡的重要分子机制,为系统阐明Sonic hedgehog信号通路调控KC增殖及凋亡的分子机制开辟了新视角,并为最终明确KC增殖和凋亡的调控机制以及KC异常性皮肤病的发病机制提供了重要的理论依据。
【关键词】：正常角质形成细胞 Sonic hedgehog信号通路 MEK/ERK信号通路 增殖 凋亡
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R751
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-15
• 文献回顾15-33
• 第一部分 实验材料33-39
• 1 仪器33-34
• 2 主要试剂34-36
• 3 主要试剂配制36-38
• 4 细胞株38-39
• 第二部分 实验方法39-52
• 1 观察Shh信号通路在正常KC中的活性及特异性调控Shh通路对KC增殖及凋亡的影响39-46
• 1.1 检测正常KC中Shh信号通路的活性状态39-42
• 1.2 调控Shh信号通路活性对正常KC增殖及凋亡的影响42-43
• 1.3 调控Shh通路活性对正常KC中cyclin D1和Bcl2表达的影响43-46
• 2 探讨Shh信号通路调控正常KC增殖与凋亡的分子机制46-49
• 2.1 调控Shh信号通路对MEK/ERK信号通路的影响46
• 2.2 调控Shh信号通路对PI3K/AKT信号通路的影响46
• 2.3 调控Shh信号通路对JAK/STAT信号通路的影响46-47
• 2.4 U0126阻断MEK/ERK通路对Shh通路调控KC增殖与凋亡的影响47-49
• 2.5 U0126对Shh信号通路诱导的cyclin D1和Bcl2表达的影响49
• 3 探讨Shh通路与EGFR通路在正常KC增殖与凋亡调控中的作用关系49-52
• 3.1 联合调控Shh与EGFR信号通路对KC增殖与凋亡的影响49-50
• 3.2 联合调控Shh与EGFR信号通路对MEK/ERK通路活性的影响50
• 3.3 联合调控Shh与EGFR信号通路对cyclin D1和Bcl2表达的影响50-51
• 3.4 统计学分析51-52
• 第三部分 实验结果52-67
• 1 Shh信号通路在正常KC中处于激活状态并调控KC的增殖与凋亡52-55
• 1.1 Shh信号通路在正常KC中处于激活状态52
• 1.2 特异性调控Shh通路活性能够调控正常KC的增殖与凋亡52-54
• 1.3 特异性调控Shh通路活性能够调控正常KC中cyclin D1和Bcl2的表达54-55
• 2 Shh信号通路调控正常KC增殖与凋亡的分子机制55-62
• 2.1 Shh通路特异性激活MEK/ERK通路，但对PI3K/AKT和JAK/STAT1/3通路活性无明显影响55-57
• 2.2 阻断ERK通路活性能够阻断Shh信号通路对KC增殖与凋亡的调控57-61
• 2.3 阻断ERK通路活性能够阻断Shh信号通路诱导的cyclin D1和Bcl2的表达61-62
• 3 Shh信号通路与EGFR通路在正常KC增殖与凋亡调控中的作用关系62-67
• 3.1 联合调控Shh与EGFR信号通路对KC增殖与凋亡的影响62-64
• 3.2 EGFR信号通路能够调控Shh信号通路的活性64-65
• 3.3 Shh通路与EGFR通路能够协同诱导ERK通路激活及cyclin D1和Bcl2的表达65-67
• 第四部分 讨论67-71
• 小结71-72
• 参考文献72-85
• 个人简历和研究成果85-87
• 致谢87

  本文关键词：Sonic hedgehog信号通路对正常角质形成细胞增殖及凋亡的影响及其分子机制，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：286429