朊蛋白在H7N7-IAV感染中的作用及机制研究

发布时间：2020-11-01 15:35

　　 甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是有包膜的、负义、单链RNA病毒,常引起季节性流感,新型IAV具有引起流感大流行的潜在风险。IAV首先通过病毒表面蛋白HA与细胞表面的唾液酸受体结合而侵入呼吸道或肺上皮细胞,病毒感染的结果取决于病毒复制和宿主免疫反应之间的平衡。IAV感染引起炎症反应的过度激活会导致促炎细胞因子的过度表达,形成的“细胞因子风暴”被认为是IAV感染机体诱导肺部炎症和引起致病性的重要原因。正常细胞朊蛋白(Normal Cellular Prion Protein,PrP~c)是一种细胞表面膜糖蛋白,在脑中表达最丰富,肺次之。PrP~c参与神经保护、免疫反应,并在各种病毒感染中发挥调节作用。最新研究表明PrP~c通过抗氧化应激能够发挥抗IAV病毒感染的作用,其机制是通过PrP~c N末端OR区与Cu~(2+)结合,进一步调节活性氧产生酶(Superoxide Dismutase,SOD1)的活性,降低细胞内过量的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的产生,抑制细胞凋亡,保护小鼠免受IAV的致死性感染。然而,PrP~c的非OR区(除了OR区以外的功能域)是不是也具有抗病毒感染的作用,目前尚未有文献深入探讨。此外,PrP~c能够在T淋巴细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等免疫细胞,以及Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮细胞和细支气管Clara细胞中表达,因此PrP~c可能在肺部的免疫系统中扮演重要角色。IAV感染肺上皮细胞,直接或间接诱导炎性细胞因子产生,但是PrP~c在IAV诱导的炎症反应中到底发挥哪些重要作用尚不清楚。基于此,本论文通过PrP~c两种基因敲除小鼠及PrP~c过表达质粒分别在体内和体外两个层次探讨其在IAV感染及炎性反应中的作用,并借助RNA-Seq测序、差异基因表达谱的分析和验证,进一步探讨其中的分子机制。主要研究内容和实验结果如下:1.从体内水平研究PrP~c对小鼠致病性的影响。首先利用CRISPR/Cas9技术构建两类PrP~(-/-)小鼠,分别是朊蛋白全基因敲除小鼠(119KO)和朊蛋白OR区敲除小鼠(120KO),比较野生型小鼠(WT)与PrP~(-/-)基因敲除小鼠(119KO和120KO)在H7N7-IAV感染后3、5、8、11天时的临床症状和肺组织病理学变化。结果表明,与WT小鼠相比,120KO小鼠更容易感染H7N7病毒,即小鼠存活率降低,体重下降明显以及肺部病理损伤更严重;而PrP~c全基因敲小鼠(119KO)不易感染H7N7病毒,即临床症状及肺组织病理学变化均轻于野生型小鼠。因此,我们推测朊蛋白在病毒感染的过程中具有双重调节作用,即朊蛋白OR区可能具有抗流感病毒感染,保护机体,减轻机体损伤的作用,而PrP~c非OR区可能对于病毒感染具有促进作用。2.对病毒感染后3、5、8、11天的120KO、119KO、WT小鼠和生理盐水对照组小鼠的肺组织进行RNA-seq分析与q-PCR验证,进一步探讨PrP~c在IAV诱导炎症反应中的作用。结果表明,H7N7感染小鼠肺后能够诱导大量细胞炎症因子表达,如TLRs通路基因(如TLR4/7/3、MyD88、TAK1、IRF3)、干扰素(IFNα/β和IFNγ)、IL6、TNFα、Nrf2和两类趋化因子及其受体(CCL2/3/11和受体CCR2/3,CXCL2/3/10/11和受体CXCR3/4/6)。与野生型WT小鼠相比,大部分细胞因子和趋化因子在120KO小鼠中的表达量显著升高,而在119KO小鼠中显著降低。因此我们认为OR区能够抑制细胞因子和趋化因子在H7N7感染后的上调表达,在IAV感染诱导的炎症风暴中发挥保护作用;而PrP~c的非OR区可能促进了炎症因子上调表达,即增强H7N7-IAV感染诱导的炎症反应。综上所述,朊蛋白的不同功能域在H7N7-IAV感染小鼠的肺损伤及炎症反应中可能具有不同的调节作用。3.通过PrP~c过表达质粒转染小鼠肺上皮细胞(MLE-12),进一步验证PrP~c在流感病毒H7N7感染中的作用。结果表明,在H7N7侵染细胞后的不同时期,病毒与PrP~c互相作用的结果不同:感染早期(12h),病毒诱导PrP~c上调表达;感染24h后,PrP~c的表达显著下降,并能持续下调病毒M基因的表达;感染48h后,PrPc的表达又开始升高。转染24h后,过表达的PrP~c诱导了MLE-12细胞中的IFN-β和TLR3显著上调,但当病毒感染后,过表达的PrP~c显著降低了IFN-β表达,升高了TLR3的表达,该结果与120KO小鼠中表达趋势一致。因此,在IAV感染过程中,PrP~c对不同的细胞因子可能有不同的调节作用。综上所述,本研究首次揭示了朊蛋白在IAV病毒感染诱导炎症反应中的作用,为朊蛋白作为抗流感的分子靶标研究提供了重要依据。另外,我们也首次对朊蛋白不同功能域所发挥的作用进行了探讨,进一步拓展了对PrP~c生理功能的认识。
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R511.7
【部分图文】：

趋化因子是由许多小分泌蛋白组成的大家族,由40多种趋化型细胞因子组成,可由多种细胞分泌,趋化因子作为免疫细胞的趋化剂发挥作用,控制白细胞在体内的迁移并招募促炎性细胞(噬中性粒细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、内皮细胞、噬酸性粒细胞等)[16]。趋化因子的生物学效应是通过与这些细胞表面的特异性G蛋白偶联受体结合,导致血管内皮细胞活化、促炎细胞通过血管迁移到炎症部位[17]。根据趋化因子N端半胱氨酸的基序,它们由CC和CXC(α类),XC(γ类)和CX3C(δ类)趋化因子[18,19]四类组成,包括调节活化正常T细胞表达与分泌的因子RANTES(CCL5配体),单核细胞趋化蛋白(MCP)MCP-1、MCP-3,巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α),干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)和白介素8(IL-8),促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和肿瘤坏死因子α(TNF-α)和抗病毒细胞因子IFNα/β[13],图1-1展示了IAV感染上皮细胞和巨噬细胞诱导分泌的细胞因子。在炎症早期,促炎性细胞因子发挥作用,细胞因子像信号弹一样,招募免疫细胞参与免疫反应,被激活的免疫细胞释放更多的细胞因子,并继续招募更多的细胞,产生更多细胞因子[20,21]。由此可见,炎症反应是随着细胞因子信号的增强而不断放大的。值得注意的是,炎症是一把双刃剑。一方面,炎症反应可以清除病原,促进损伤组织细胞修复,维护机体环境;另一方面,免疫细胞在打击病原体的过程中,不具有特异性,释放的杀伤性物质也会损伤正常组织[22]。促炎细胞因子和抗炎细胞因子同时在体内发挥作用,就有可能造成一种极度复杂的免疫功能紊乱。在加重炎症反应的同时,也会使得机体对病原体的识别和吞噬功能减弱,引起机体免疫防御能力下降[23]。

干扰素IFN是免疫系统的重要组成部分之一,名字源于其干扰病毒复制的能力。目前,根据抗原结构和产生的活性,已经识别出I型和II型IFN。I型IFN主要在调节自然免疫中发挥作用,II型IFN主要协调细胞免疫。IFNγ属于II型IFN,由淋巴细胞、巨噬细胞等分泌,具有多种功能。IFNα和IFNβ属于I型IFN,分别由淋巴细胞和上皮细胞分泌。IFNα/β是直接的抗病毒介质,并具有抗增殖和免疫调节活性[16,37],通常在病毒感染后数小时内被诱导激活,可以上调趋化因子MCP-1、MCP-3和IP-10的表达,诱导单核细胞、巨噬细胞和Th1型细胞进一步募集到感染部位[38]。IFNα/β与被感染细胞和邻近细胞表面的共同受体(IFNAR)相互作用,通过多条级联反应信号通路诱导数百种基因(IFN刺激基因,ISGs)的转录,包括包括RIG-I、Mda5、IRF7、TLR3/7、STAT1[39],以及抑制病毒复制的蛋白编码基因[40]。此外,IFN自身通过正反馈回路触发诱导IFN表达的蛋白,如RIG-I、IKK3、STAT等的表达。而IFN刺激的基因ISGs通过各种机制抵消IAV的复制和传播[39],暗示了ISG抗病毒反应的正反馈机制。其中一些通路在图1-2中展示。自1918年20世纪第一个有记录的流感大流行开始,流感病毒通过突变和重组而显示出高遗传和抗原多样性,逐步表现出适应哺乳动物宿主的重要变化[41]。IAV的分布广泛性和宿主多样性使它们能够适应包括人类在内的不同鸟类和哺乳动物宿主。近年来,已经出现新的AIV具有跨越动物-人的物种屏障并在人类中引起轻度或致命的并发症,存在形成新的更易感染人类的病毒亚型并在人群中传播的风险;随着IAV获得对目前可用的抗流感药物如病毒神经氨酸酶(NA)抑制剂的抵抗力,因此,寻找新的抗流感药物的靶分子变得尤为迫切。

代替核酸,PrPsc蛋白质成为能够自我复制的病原体,从根本上改变了“传染性”的概念[51]。PrPsc是PrPc的异常构象,主要结构由α螺旋转变成β折叠[52,53]),PrPsc能够形成紧密的、不溶性、蛋白酶耐受的蛋白聚集体在脑中积累[54],并且对经典病原体灭活程序不敏感。PrPsc转化为PrPc已经有几种模型和假说,最基本的解释是感染过程中PrPsc将PrPc转化为PrPsc并引起一些突变,使得蛋白变得不稳定[55],后者的结合会使PrPc继续转化,导致PrPsc进一步积累[56,57](见图1-3)。这一假说同朊蛋白突变体的进展性和Prnp敲除小鼠对患瘙痒症羊脑提取物的抗感染性状一致[57]。病原体(图1-3亮绿色)感染正常PrPc蛋白(叉状)发生构像变化,而进入神经系统。异常异构体整合到β折叠构成的蛋白(不断增长的蓝色片状)中,破坏α螺旋结构。功能获得性假说的基本原则是PrPsc聚集会使神经元对程序性细胞凋亡敏感并诱发病毒性疾病[58]。功能丧失假说则是,PrPc的丧失会导致细胞脆弱和病毒性疾病[59]。两种假说并非互相排斥,但PrPsc积累、细胞凋亡和疾病发生之间的相互依赖性关系依然有待解决。1.3.2 朊蛋白的结构与生理功能
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 Bryon Ellis;Leah Kaercher;Courtney Snavely;;Lipopolysaccharide triggers nuclear import of Lpcat1 to regulate inducible gene expression in lung epithelia[J];World Journal of Biological Chemistry;2012年07期

2 Peter C Konturek;Karolina Bazela;Vitally Kukharskyy;Michael Bauer;Eckhart G Hahn;Detlef Schuppan;;Helicobacter pylori upregulates prion protein expression in gastric mucosa: A possible link to prion disease[J];World Journal of Gastroenterology;2005年48期

相关博士学位论文 前2条

1 贾燕青;新城疫病毒感染鸡胚miRNAs和mRNAs表达谱分析与抗病毒基因的筛选[D];西北农林科技大学;2018年

2 薛瑞雪;貂源H9N2亚型流感病毒对小鼠致病性与宿主hnRNP H1抑制流感病毒复制机理研究[D];山东农业大学;2018年

本文编号：2865738