第一部分高血压诱导血管内皮细胞TXNIP表达上调目的:高血压病程中伴随着明显的“氧化-抗氧化”失衡,氧化应激是导致血管内皮细胞功能障碍的重要原因之一。硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)是体内重要的促氧化蛋白,在多种病理条件下可以被激活,进而促进组织细胞发生氧化性损伤。本部分主要探讨高血压状态下血管内皮细胞中TXNIP的表达变化及其影响机制。方法:使用“两肾一夹”(two-kidney and one-clip,2K1C)构建高血压大鼠动物模型,将30只雄性SD大鼠随机分为:正常对照组(control)、假手术组(sham)、高血压组(hypertension),每组10只。使用无创尾动脉血压测量仪定期监测各组大鼠的血压和心率,排除建模不成功的大鼠。4周后收取各组大鼠心脏、主动脉和颈动脉进行苏木精-伊红染色、免疫组化和Western blot检测;同时使用酶联免疫吸附法检测大鼠血浆血管紧张素(angiotensin,Ang)Ⅱ的浓度。体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),外源性使用Ang Ⅱ刺激细胞,模拟高血压状态下的内皮损伤;检测不同浓度和时间Ang Ⅱ处理后HUVEC中TXNIP的表达变化。使用Losartan(AT-1R阻断剂)和Tempol(一种可透膜的抗氧化剂)预处理HUVEC后,分别使用Western blot和细胞免疫荧光检测Ang Ⅱ刺激状态下HUVEC中TXNIP的表达变化。结果:(1)建模后高血压组大鼠的血压逐渐升高,术后4W时,高血压组的收缩压(181±6 vs.120±5 mmHg;P0.01)和舒张压(156±8 vs.105±3 mmHg;P0.01)均明显高于假手术组,各组间心率无显著变化。(2)与假手术组相比,高血压大鼠的心脏质量指数(4.38±0.16vs.3.67±0.19;P0.05)、心肌细胞面积(586±44 vs.353±27μm~2;P0.01)、颈动脉和主动脉中膜厚度(38.28±2.37 vs.23.64±1.68μm;82.04±2.52 vs.54.68±1.43μm;均P0.05)均显著增加,血浆Ang Ⅱ的浓度也明显升高(556.18±9.14 vs.501.78±7.16 pg/mL,P0.01)。(3)与假手术组相比,高血压大鼠颈动脉和主动脉血管组织中TXNIP的蛋白表达水平明显升高,免疫组化进一步显示血管内皮细胞中TXNIP的升高最为显著。(4)体外实验发现Ang Ⅱ可以上调HUVEC中TXNIP的蛋白表达,且具有一定的时间依赖性。(5)Losartan和Tempol均可显著抑制Ang Ⅱ诱导的TXNIP表达上调。结论:高血压状态下,血管内皮细胞中TXNIP的表达上调,这一现象可能与Ang Ⅱ诱导的细胞氧化应激有关。第二部分TXNIP对高血压大鼠血管内皮功能的影响目的:血管内皮是血液循环和血管壁之间的屏障,可以分泌多种血管活性物质,对于维持血管张力和血流动力学稳定具有重要意义。高血压可以导致血管内皮功能障碍,但具体的损伤机制目前仍未完全阐明,本部分主要探讨TXNIP对高血压大鼠血管内皮功能的影响。方法:将32只雄性SD大鼠随机分为以下4组(每组8只):假手术组(sham)、假手术+TXNIP抑制剂组(sham+Resveratrol)、高血压组(hypertension)、高血压+TXNIP抑制剂组(hypertension+Resveratrol)。采用2K1C法构建高血压大鼠模型,建模后第二天予以Resveratrol(2mg/kg/d)或等体积的溶剂灌胃,连续给药4W后收取大鼠颈动脉、胸主动脉和血浆。血管张力测定仪检测大鼠胸主动脉的内皮依赖性舒张功能。Western blot检测大鼠血管组织中TXNIP、e NOS、p-e NOS(ser 1177)以及几种经典的氧化还原反应调节蛋白(NOX2、NOX4、SOD2、NRF2)的表达。通过检测血浆丙二醛(malondialdehyde,MDA)浓度、SOD活性以及主动脉二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)染色评估全身及血管组织的氧化应激水平。结果:(1)Resveratrol可以明显抑制大鼠颈动脉和主动脉血管组织中TXNIP的表达。(2)与假手术组相比,高血压大鼠胸主动脉对乙酰胆碱诱导的血管舒张反应明显减退,同时血管组织中e NOS的蛋白表达和p-e NOS(ser 1177)/e NOS比率明显减低(均P0.05);抑制TXNIP可以显著改善高血压大鼠血管的舒张功能,同时上调血管组织中e NOS的蛋白表达和功能激活(均P0.05)。(3)高血压大鼠全身及血管组织出现明显的氧化应激;与高血压大鼠相比,抑制TXNIP后高血压大鼠的血浆MDA浓度明显降低(9.39±1.11 vs.16.61±0.67μM;P0.05),SOD活性明显增加(68.65±6.37 vs.48.18±4.61 U/m L;P0.05);DHE染色显示抑制TXNIP可以有效减少高血压大鼠主动脉血管组织中ROS生成(P0.01);Western blot进一步显示抑制TXNIP可以上调高血压大鼠主动脉血管组织中抗氧化蛋白(SOD2和NRF2)的表达,抑制氧化酶(NOX4和NOX2)的表达。结论:高血压大鼠血管内皮依赖性舒张功能减退,抑制TXNIP可以显著改善高血压大鼠血管内皮功能,抑制全身及血管组织的氧化应激。第三部分TXNIP对人脐静脉内皮细胞功能的调控作用目的:高血压病程中,血液循环中升高的Ang Ⅱ是导致内皮功能障碍的主要病理刺激因素之一,Ang Ⅱ可以通过促进细胞氧化应激和凋亡等方式诱导血管内皮细胞功能损伤。本部分主要探索外源性Ang Ⅱ刺激下,TXNIP对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)功能的调节作用。方法:构建特异性TXNIP小干扰RNA(si RNA)和阴性对照(negative control,NC)RNA,体外转染HUVEC,随后使用Ang Ⅱ(10-6M)处理HUVEC。根据处理方式不同,分为以下5组:Control、Control+TXNIP-si RNA、Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+NC-si RNA和Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA。DCFH荧光染色检测细胞内ROS生成;Annexin V/PI染色、流式细胞仪检测细胞凋亡;DAF-FM荧光染色检测细胞内一氧化氮(nitric oxide,NO)的合成。Western blot检测AKT、p-AKT(ser 473)、e NOS、p-e NOS(ser 1177)以及其他氧化还原反应调节蛋白(NOX2、NOX4、SOD2、NRF2)和凋亡相关蛋白(ASK1、BCL2、BAX、cleaved-Caspase 3、Caspase 9)的表达变化。结果:(1)TXNIP-si RNA可以显著抑制HUVEC中TXNIP在m RNA和蛋白水平的表达(均P0.01),NC-si RNA对TXNIP的表达无明显影响(P0.05)。(2)与Control组相比,Ang Ⅱ处理后HUVEC细胞内ROS生成增多,细胞凋亡率明显升高;同时e NOS的活性下调,细胞内NO的合成明显减少(均P0.05)。(3)与Ang Ⅱ+NC-si RNA组相比,敲减TXNIP可以明显减少Ang Ⅱ刺激下HUVEC中ROS的生成(P0.01),同时抑制NOX2和NOX4的蛋白表达,上调SOD2和NRF2的蛋白表达(均P0.05)。(4)与Ang Ⅱ+NC-si RNA组相比,Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA组中HUVEC的细胞凋亡率明显降低[(8.75±0.23)%vs.(14.23±1.60)%,P0.05],ASK1、cleaved-Caspase 3和Caspase 9的蛋白表达也显著降低(均P0.05),而BCL2/BAX的比值升高(P0.05)。(5)Ang Ⅱ刺激状态下,敲减TXNIP可以上调HUVEC中p-AKT(ser473)/AKT和p-e NOS(ser 1177)/e NOS的比值(均P0.05),并能部分恢复细胞内受损的NO合成(P0.05)。结论:TXNIP参与并介导了Ang Ⅱ诱导的血管内皮细胞功能障碍,抑制TXNIP可以通过减轻氧化应激和细胞凋亡改善血管内皮细胞的生理功能。第四部分TXNIP调控血管内皮细胞功能的机制研究目的:TXNIP是体内主要的内源性硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)系统抑制蛋白。然而高血压状态下,TXNIP是否通过影响TRX系统的激活进而导致血管内皮细胞功能障碍目前仍不明确。本部分主要探索TXNIP调控血管内皮细胞功能的内在分子机制。方法:TXNIP-si RNA和NC-si RNA转染HUVEC后外源性使用Ang Ⅱ处理细胞,分组方式与第三部分相同。RT-q PCR、Western blot、细胞免疫荧光检测各组细胞中TRX的表达;提取HUVEC核蛋白检测细胞核中TRX、AP-1、REF-1的表达;使用硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TRXR)试剂盒检测细胞中TRXR活性变化。随后使用PX-12(一种TRX的抑制剂)预处理HUVEC,根据处理方式不同,分为以下4组:Control组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA组、Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA+PX-12组;检测各组细胞内ROS、细胞凋亡率以及e NOS和p-e NOS(ser 1177)的蛋白表达变化。以GV230为载体构建TRX过表达质粒(GV230-TRX)和阴性对照质粒(GV230-NC),分别转染HUVEC,分别在正常或Ang Ⅱ刺激状态下,检测HUVEC中e NOS和p-e NOS(ser 1177)的蛋白表达及细胞内NO的合成变化。结果:(1)Ang Ⅱ可以代偿性激活HUVEC的TRX系统,与Control组相比,Ang Ⅱ组中TRX的m RNA和蛋白水平均有所升高(均P0.05),但TRXR活性无明显变化(P0.05)。(2)与Ang Ⅱ+NC-si RNA组相比,Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA组中TRX的蛋白和m RNA表达水平进一步增加,TRXR的活性显著增强(均P0.05)。(3)Ang Ⅱ刺激状态下,敲减TXNIP可以促进HUVEC中TRX发生核转位,上调细胞核内转录因子AP-1和REF-1的蛋白表达(均P0.05)。(4)TXNIP对HUVEC氧化应激、细胞凋亡和e NOS功能激活的调节作用可以被PX-12完全逆转。(5)Ang Ⅱ刺激状态下,过表达TRX可以显著上调HUVEC中p-e NOS(ser 1177)/e NOS的比值,并能促进细胞内NO的合成(均P0.05)。结论:高血压状态下,TXNIP主要是通过负调控TRX系统的方式介导血管内皮功能障碍;维持TXNIP/TRX系统的稳态可能有助于减轻高血压对血管内皮细胞的损伤。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R544.1
【部分图文】：
⑤逐层缝合肌层、筋膜和皮肤后,再次消毒手术区域;将大鼠放于温暖的毛毯上,待其完全清醒后放回笼中继续饲养。(4)血压、心率监测:使用动物无创血压计监测大鼠清醒状态下的血压和心率。先将大鼠进行适应性训练,每次在相同的时间段内进行。血压监测前维持环境温度24℃左右,周围环境安静。将大鼠安抚后放置于固定囊袋中,露出鼠尾,用温热的毛巾擦拭使其尾动脉充分扩张;将加压尾套放置于鼠尾根部,使其与尾动脉紧密贴合;在大鼠充分安静状态下,打开血压监测系统,待屏幕上的脉搏波信号出现并持续稳定5min后开始测血压和心率,连续测量5次,取平均值并记录。
(5)建模评估:所有大鼠术前均进行基础血压测定,术后每周定期进行常规血压和心率测定。建模4W后,若收缩压大于160mmHg以上,且解剖后左肾无坏死、萎缩或纤维化则判断为建模成功[26];反之建模失败,重新建模。建模4W后,各组大鼠的实时血压和心率监测波形如图1.2。1.3.2心脏、血管组织苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色
各组大鼠在术前的基线血压和心率均无显著差异(P>0.05),建模后每周检测各组大鼠的血压和心率,结果发现随着时间延长,高血压组大鼠的收缩压(systolic pressure,SBP)和平均动脉血压(mean blood pressure,MBP)均逐渐升高,而假手术组和对照组大鼠的SBP和MBP均无显著变化,提示通过2K1C手术可以成功诱导大鼠发生高血压。建模4W后,与假手术组大鼠相比,高血压组大鼠的SBP显著升高(181±6 vs.120±5 mmHg,P<0.01),MBP也显著升高(156±8 vs.105±3 mmHg,P<0.01)。各组大鼠的心率无明显差异(数据未展示,P>0.05)。2.2高血压大鼠血浆Ang II升高
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