MCLR与TiO_2NPs肝细胞暴露的炎症信号响应

发布时间：2017-04-05 08:04

  本文关键词：MCLR与TiO_2NPs肝细胞暴露的炎症信号响应，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：针对环境微污染人体健康的毒性预警问题,面对中国南方水体微囊藻毒素污染诱导的化学性损伤和局部水源中纳米材料污染带来的物理性损伤,本研究选取典型微囊藻毒素(MCLR)和两种纳米二氧化钛(TiO2NPs)材料(锐钛矿和金红石),采用体外原代与离体肝细胞系实验模型,突破肝细胞敏感炎症信号转导及免疫风险表达技术,解析细胞亚显微结构应激损伤及信号转导失调潜在机制,揭示炎症信号通路MAPK和NF-κB对MCLR与TiO2NPs单一及复合暴露响应的剂量效应规律,提供环境微污染早期肝炎风险敏感预警方法。主要研究结果如下：(1)MAPK和NF-κB炎症信号通路被MCLR磷酸化激活介导其肝炎风险1-1000μg/L MCLR暴露24h后,引起原代小鼠肝细胞(PMHs)活力显著下降p0.05),其蛋白降解EC50值为11.86±1.01-14.49±3.74μg/L；而在人肝细胞系(HepG2)内未引起显著细胞毒性,表明原代肝细胞PMHs对MCLR响应较HepG2更为敏感。运用免疫印迹和荧光素酶报告系统测定炎症信号通路MAPK和NF-κB激活结果表明亚细胞致死剂量MCLR引起PMHs(25μg/L)和HepG2(1000μg/L)细胞内MAPK和NF-κB显著磷酸化激活(p0.05)。MAPK和NF-κB通路激活介导下游炎性因子IL-6蛋白表达上调,证实MCLR对肝细胞的促炎作用。MAPK和NF-κB对MCLR和炎性因子TNFa复合暴露的激活响应表明MCLR预暴露使肝细胞呈高敏状态促进TNFa诱导的MAPK和NF-κB通路激活及IL-6表达,有效指示炎症敏感人群MCLR二次暴露风险。TEM亚显微结构观察进一步指出PMHs内线粒体对MCLR暴露最为敏感,在大于25μg/L剂量下其双层膜破裂,内部嵴结构和基质流失,表明线粒体结构损伤可能介导MAPK和NF-κB信号转导失调。(2) MAPK和NF-κB通路对TiO2NPs差异性动态响应受其团聚形态调控TiO2NPs在高于160μg/mL剂量下致肝细胞HepG2显著死亡(p0.05),金红石细胞毒性强于锐钛矿。在亚细胞致死剂量5-160μg/mL TiO2NPs暴露下,HepG2内MAPK通路中的ERK1/2、p38及NF-κB通路中的IκBα磷酸化表达显著上调p0.05),与暴露剂量呈正相关。两种TiO2NPs诱导MAPK和NF-κB动态激活规律在24h暴露内存在差异,金红石与锐钛矿对p38的磷酸化在暴露1h和12h达到峰值,而金红石诱导ERKl/2的激活峰值出现在9 h,早于锐钛矿的12 h,p-IκBα对两者的动态响应规律则分别呈Bell型和S型分布。MAPK和NF-κB对金红石与锐钛矿的差异性动态响应主要归因于纳米颗粒团聚体的二次粒径效应,团聚粒径小的金红石较锐钛矿具有更大激活潜能,并诱导下游较强的炎性因子TNFα、A20表达和细胞毒性响应,表明MAPK和NF-κB信号即早应答介导不同TiO2NPs肝炎风险差异。进一步AFM细胞生物力学测定结果表明TiO2NPs诱导细胞杨氏模量和粘附力显著增加,细胞弹性减弱,揭示TiO2NPs生物膜界面胞吞作用触发细胞骨架重构可能是其对信号通路间接激活的潜在机制。(3) MAPK和NF-κB通路对MCLR与TiO2NPs复合暴露呈协同与拮抗响应在10-1000μg/L MCLR和10-40 μg/mL TiO2NPs复合暴露下,HepG2细胞内MAPK通路中的ERK1/2、p38磷酸化水平较单一暴露显著增强(p0.05),而NF-κB通路中IκBα磷酸化水平较单一暴露有所降低。MAPK和NF-κB动态响应规律亦表明MCLR和TiO2NPs复合暴露促进ERK1/2、p38最大磷酸化进程,其中ERK1/2激活峰值从12h提早至8h,p38从4h提早至1h；而对于NF-κB通路,MCLR减弱TiO2NPs诱导的IκBα磷酸化程度,但未改变其动态变化规律。炎症信号通路激活响应面分析及药物交互作用指数表明MCLR与TiO2NPs复合暴露对MAPK激活呈协同或相加作用,而对NF-κB激活呈拮抗作用。MCLR与TiO2NPs复合体系动态光散射分析表明两者交互作用显著降低TiO2NPs表面Zeta电位和锐钛矿团聚粒径,可改变所吸附MCLR的细胞转运从而介导胞内炎症信号通路复合应激响应。
【关键词】：微囊藻毒素 纳米二氧化钛 肝炎 MAPK/NF-κB信号通路 敏感标记物
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 缩写词表12-17
• 第一章 绪论17-47
• 1.1 环境典型微污染及其暴露风险17-28
• 1.1.1 MCs与TiO_2NPs微污染环境典型意义17-22
• 1.1.2 MCs与TiO_2NPs单一及复合暴露风险22-27
• 1.1.3 环境微污染暴露评价研究方法27-28
• 1.2 典型微污染健康损伤机制及其预警研究方法28-37
• 1.2.1 MCs肝毒作用机制29-31
• 1.2.2 TiO_2NPs纳米毒性及其分子机制31-34
• 1.2.3 微污染健康风险预警分子标记物研究进展34-37
• 1.3 细胞炎症信号通路及其调控机制37-44
• 1.3.1 MAPK/NF-κB通路信号转导调控38-42
• 1.3.2 MAPK/NF-κB可逆磷酸化信号转导研究方法42-43
• 1.3.3 MAPK/NF-κB信号通路对环境微污染应激响应43-44
• 1.4 本论文研究工作44-47
• 1.4.1 研究目标和意义44
• 1.4.2 拟解决的科学问题44-45
• 1.4.3 研究内容和技术路线45-47
• 第二章 MCLR诱导MAPK/NF-κB信号通路胁迫响应47-66
• 2.1 前言47-48
• 2.2 材料与方法48-54
• 2.2.1 材料与仪器48-51
• 2.2.2 肝细胞模型筛选51
• 2.2.3 细胞暴露浓度梯度及毒性测定51-52
• 2.2.4 MAPK与NF-κB信号转导检测52-53
• 2.2.5 IL-6表达ELISA测定53-54
• 2.2.6 细胞亚显微结构损伤表征54
• 2.2.7 数据统计分析54
• 2.3 结果54-64
• 2.3.1 原代肝细胞与离体肝细胞系对MCLR的敏感性差异54-55
• 2.3.2 HepG2细胞NF-κB/MAPK信号通路对MCLR应激响应55-59
• 2.3.3 原代肝细胞NF-κB/MAPK信号通路对MCLR应激响应59-61
• 2.3.4 MCLR诱导肝细胞炎性因子IL-6表达61-63
• 2.3.5 MCLR对肝细胞亚显微结构的损伤63-64
• 2.4 讨论64-65
• 2.5 小结65-66
• 第三章 TiO_2NPs诱导MAPK/2NF-κB信号转导机制66-85
• 3.1 前言66-67
• 3.2 材料与方法67-71
• 3.2.1 实验材料67
• 3.2.2 细胞培养与暴露67-68
• 3.2.3 肝细胞毒性测定68
• 3.2.4 MAPK与NF-κB信号转导检测68-69
• 3.2.5 炎性因子mRNA表达测定69
• 3.2.6 细胞亚显微结构损伤表征69-71
• 3.2.7 数据统计分析71
• 3.3 结果71-83
• 3.3.1 TiO_2NPs团聚特性71-73
• 3.3.2 TiO_2NPs肝细胞毒性73-75
• 3.3.3 TiO_2NPs诱导MAPK/NF-κB信号通路动态激活规律75-80
• 3.3.4 TiO_2NPs诱导炎性因子表达80-81
• 3.3.5 TiO_2NPs对肝细胞亚显微结构的损伤81-83
• 3.4 讨论83-84
• 3.5 小结84-85
• 第四章 MCLR与TiO_2NPs对MAPK/NF-κB信号转导复合作用85-99
• 4.1 前言85-86
• 4.2 材料与方法86-87
• 4.2.1 混合体系理化特性鉴定86
• 4.2.2 肝细胞毒性测定86
• 4.2.3 MAPK与NF-κB信号通路激活86-87
• 4.2.4 数据统计分析87
• 4.3 结果87-96
• 4.3.1 MCLR对TiO_2NPs团聚特性影响87-88
• 4.3.2 MCLR与TiO_2NPs复合肝细胞毒性88-89
• 4.3.3 MCLR与TiO_2NPs对MAPK/NF-κB激活的复合效应89-94
• 4.3.4 MCLR与TiO_2NPs复合诱导MAPK/NF-κB动态激活规律94-96
• 4.4 讨论96-98
• 4.5 小结98-99
• 第五章 研究结论、创新点与展望99-102
• 5 .1研究结论99-100
• 5.2 创新点100-101
• 5.3 展望101-102
• 参考文献102-126
• 作者简介及攻读博士学位期间完成的学术论文126

  本文关键词：MCLR与TiO_2NPs肝细胞暴露的炎症信号响应，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：286725