高通量测序技术在急性髓系白血病临床检测中的方法学建立及其初步应用

发布时间：2020-11-05 15:14

　　 研究背景与目的急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)是一组高度异质的造血系统恶性肿瘤。细胞遗传学异常是AML疾病诊断、评价预后和治疗方案的选择中最重要的独立预后指标之一。而应用现有的染色体分析技术,目前仍有约50%左右的成人AML患者未能发现有显微镜下可见的染色体核型异常。这些所谓正常核型的AML (cytogentically normal AML, CN-AML)患者通常被划分在中等预后组,但临床结局却大不一样,提示他们之间存在较大的异质性,因此分子生物学异常在其发病和判断预后中的价值就更为突出。分子生物学技术的发展为科学家们从微观层面发现疾病的发生机制提供了更宽阔的视野,在AML中已经发现了许多特征性的分子异常,包括基因表达水平异常、基因突变以及基因的转录修饰等等,而且不断有新的基因异常指标被加入进来。随着更多新的基因异常出现,科学家们发现基因突变与预后的关系不能简单地用一个基因异常来解释,不同突变组合有不同的临床意义,各种基因突变综合考虑才能较好地反应患者的真实预后。因此临床医生需要更为详尽的基因突变谱综合判断疾病的预后、指导个体化治疗。现在临床研究的重点是如何在短时间内获得有价值的基因异常以指导制定合理的治疗方案,目前多采用经典的Sanger测序方法对目标基因进行突变检测,该测序法可以检测出各种各样的突变类型,但检测灵敏度只有20%左右。用位点特异性PCR的方法进行检测,检测灵敏度可达1‰～1%,但只能对特定的位点进行检测。若同时检测若干个基因片段,时间会相应延长,检测的基因片段越多,所需标本量越大,分析越费时间,费用越昂贵。因此,传统的测序技术无法满足日益增长的临床工作的需求,成了制约AML分子研究及临床应用的瓶颈。临床医生希望的是在短时间内通过检测少量的标本能够获得更多的信息,同时尽量减轻反复抽取患者骨髓等标本带来的痛苦。因此建立一套高效、快捷、灵敏而经济的新的检测手段,来充分体现其在疾病个体化治疗中的价值,是当前临床诊断和医学研究急需而且是必要的。新一代测序技术(Next generation sequencing, NGS)具有通量大、测序时间短、精确度高、费用低和信息量丰富等优点,研究者可以在短时间内对感兴趣的基因进行精确定位和分析,在临床检测中有广泛的应用前景。Ion Torrent个体化基因组测序仪(Personal Genome Machine, PGM)是Thermo Life公司最新推出的一款新一代测序仪。Ion Torrent是一种基于半导体芯片的新一代测序技术,具有以下技术特点：准确度高：使用无标记的核苷酸及酶进行测序,本底干扰低。通过对H+的检测,明显提高碱基判读准确性；速度更快：测序时间仅为2-3小时,单日测序量达Sanger测序法的数千倍以上；灵活性大：可以根据检测要求灵活选择通量为10M、100M和1G芯片。其应用范围覆盖Sanger和已有高通量测序技术的应用,如线粒体测序、微生物基因组测序、RNA测序,表观遗传学,DNA扩增子测序等。Thermo Life公司基于其多年做PCR的经验,推出了AmpliSeq建库方案,该专利技术以多重PCR为反应基础,同时又突破了以往多重PCR的已知障碍,仅利用少量的起始DNA,就可以实现成千上万个目标基因的扩增能够在单管多重PCR反应内完成。目前该技术用于AML突变检测的研究还较少,商业化的Cancer Hotspot Panel中大多涉及的是实体肿瘤基因突变,而AML一些新发现的基因并不在此列,Ion Torrent测序平台的可扩展性允许研究人员可以根据自己的研究目的适当的增加测序目的基因。我们在Ion AmpliSeq Cancer HotspotPanel V2试剂盒基础上,新增了一些AML相对特异的基因突变：WT1、 DNMT3A、CEBPA、RUNX1、PHF6、ASXL1、MLL、JAK1、 PAX5、SF3B1、 SH2B3、SRSF2、TET2、EBF1、DNMT1、DNMT3B、DNMT3L17个基因,重新设计定制了多重PCR测序引物池。新设计的试剂盒一方面尽可能的囊括目前有临床指导意义的基因,另一方面,也希望能发现一些新的位点异常。本课题第一部分的目的在于研究Ion Torrent PGMTM测序平台及自制的AML Cancer Panel在AML临床诊断中的方法学建立。伴有t(8；21)(q22；q22)遗传学异常的AML是较常见的一类AML,约占成人AML的10%-15%,90%的t(8；21)易位发生在FAB分型AML-M2中,其余见于M0、M1、M4及骨髓增生异常综合征(MDS)和治疗相关性AML中,伴有这类染色体易位的AML通常被认为预后较好,特别是高剂量阿糖胞苷作为强化巩固治疗手段后,但此类AML异质性较大,仍然有30-50%的患者出现复发并对化疗药物耐药。提示了一些患者可能伴有不良的分子事件,并暗示我们需要寻找新的提示预后的标记并据此来调整治疗方案。以往研究基因突变的传统方法Sanger测序因技术本身的局限性,使其在研究基因突变谱时受到了很大的限制,因此对t(8；21)AML细胞基因突变研究往往集中在有限的目标基因中。更鲜有报道从大范围目标基因水平上来比较t(8；21)AML初发和复发时的基因突变谱变化。本课题第二部分利用新建立的Ion Torrent PGMTM测序平台,对t(8；21)AML患者初发和复发时自身配对骨髓标本的基因突变情况进行检测,以期从分子生物学角度分析t(8；21)AML患者初发和复发时的克隆演化情况,为该类患者选择合适的再治疗措施提供依据。材料与方法第一部分研究对象：2012.10-2013.12期间在南方医院血液科诊治的初发CN-AML患者标本27例,采集研究对象初次治疗前的骨髓标本,其中14例患者从新鲜骨髓标本中提取核酸待检,13例患者从骨髓细胞涂片上提取核酸待检。方法：1、目标基因筛选和多重PCR引物设计利用Ion AmpliSeq Designer (www.ampliseq.com)引物设计工具,对感兴趣的67个目标基因进行多重PCR引物设计,其中50个基因的信息来自IonAmpliSeqTM Cancer Panel V2方案,另增加的17个基因信息通过大量查阅文献获得。2、样本准备按照DNA提取试剂盒说明书操作,分别从骨髓细胞涂片和新鲜骨髓标本中提取核酸。3、NGS测序1)构建文库用Qubit dsDNA试剂盒检测DNA浓度,稀释到5ng/ul。依据仪器配套试剂盒说明书,经扩增目标DNA、消化引物、加barcode接头、纯化扩增文库后,采用Ion Library Quantitation Kit对文库定量。2)乳液PCR和阳性模板富集采用Ion PGMTM Template OT2 200 Kit进行乳液PCR；用Dynabeads(?) MyOneTM Streptavidin C1 Beads进行阳性模板富集。以上两步反应在Ion OneTouchTM ES仪上进行。3) Ion Torrent PGM测序用The Ion 316 Chip Kit,在PGM上测序,测序结果用PGM服务器配套的Ion Torrent Software Suite数据分析软件进行初步分析,得到整体数据量、变异信息、平均测序深度和参考序列匹配程度等数据。原始结果再经过一系列的过滤条件之后,得到最终结果。参考序列为人类基因组GRCh37。4、Sanger测序用传统的Sanger方法检测所有标本的FLT3-ITD、NPM1和DNMT3A三个基因的突变情况作为对照。第二部分研究对象：按照WH02008诊断标准诊断的复发t (8; 21) AML患者11例,分别选取每1例患者初次诊断治疗前和复发时的自身配对骨髓标本进行研究。方法：1、NGS测序方法与第一部分相同。2、Sanger测序用Sanger测序检测所有标本的C-KIT基因8和17号外显子的突变情况作为对照。3、突变位点致病性预测用polyphen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、mutationtaster (http://www.mutationtaster.org/cgi-bin/MutationTaster/MutationTaster69.cgi)和MAPP-MMR (http://mappmmr.blueankh.com/)三款软件来预测重现性突变位点的致病性。结果第一部分1、Ion AmpliseqTM Desinger多重PCR引物设计方案用Ion AmpliseqTM Desinger对目标基因设计多重PCR引物,设计方案结果：共652个扩增子,可以覆盖98.03%的目标区域,PCR扩增在两管内完成,分别有332和320个扩增子,扩增子的长度在125bp和275之间。2、NGS质控以一张芯片结果为例,测序结果显示：芯片中磁珠覆盖面积为80%,其中连接有文库的为100%,除去34%的多克隆,12%的低质量文库和1%测试片段,最终有效的文库为57%,共2,884,511个读取片段；产生的原始测序数据总量为409Mb：平均扩增子长度为139bp；测序每次添加核苷酸时,释放的H+强度较一致；不同位置碱基的准确度都在98%以上；其中达到Q20(与参考序列99%匹配)的为352 Mb。单个样品测序质控显示：测序覆盖度较均一,可以与靶标区比对上的reads总数为493,804,占总靶标区的96.15%,每个碱基的平均覆盖度为517,碱基覆盖的均一度为85.15%,可以被reads覆盖的靶标区的碱基比例为94.51%,靶标区内至少有20条reads比对上的碱基的比例为97.47%,没有正/反链偏好性的碱基的比例为81.92%,大部分扩增子的GC含量都在50%附近,每个扩增子的覆盖度比较均一,大部分分布在100-1000x之间,能从头到尾测通的reads大部分超过了50%。说明NGS质控合格。3、样本突变整体分布经过查询dbSNP、COSMIC等数据库以及参照文献报道,去除常见SNP位点后,67个目标基因中,有两例以上出现重现性突变的基因共有18个,突变类型包括单碱基替换、插入和缺失。突变发生频率最高的是NPM1、DNMT3A. FLT3和TET2(突变频率分别为22.2%,22.2%,18.5%和18.5%)。如：NPM1的插入突变集中在12号外显子上4个碱基的插入(c.859_860insTCTG, c.861_862insTGCA),其中5例患者为A型突变,均插入TCTG四个碱基,引起NPM1蛋白C端的框移突变；FLT3突变有两种模式,插入突变和点突变,3例为发生在近膜结构域14、15外显子的内部串联重复(ITD)插入,2例为激酶结构域20外显子的第835个天门冬氨酸的点突变(TKD),其中1例患者同时有ITD和TKD两种突变。DNMT3A和TET2属于表观遗传调节基因子,以点突变为主,DNMT3A检出的6例突变中,5例为发生在23号外显子上第882位点精氨酸的点突变,其中4例为R882H,1例为R882C。测序结果不但可以显示基因突变的类型,在染色体上的位置,还可以显示突变碱基所占的比例,进而可以用于疾病进展过程中微小残留的监测。4、Sanger测序结果对所有标本的FLT3-ITD(exon14、15)、NPM1 (exon12)和DNMT3A(R882位点附近)进行经典的Sanger测序,共检测到：FLT3-ITD阳性4例,NPM1阳性6例,DNMT3A阳性5例。与NGS结果比较发现,在扩增目的片段一致的前提下,NPM1和DNMT3A的检测两种方法有很好的一致性,Sanger测序检测到FLT3-ITD突变4例阳性样品中,仅有1例用NGS未测出。第二部分1、NGS质控本部分研究检测的芯片数据质控均合格,所有测序样本的测序深度均在100-399X之间,90%以上的序列可以与靶标区目的序列比对上,靶标区碱基覆盖度较均一。2、NGS测序结果对11例t(8；21)AML患者初诊和复发时的自身配对骨髓标本同时进行了NGS测序,结果显示：所有检出的突变以杂合型突变为主,而且在初发和复发时的突变细胞比例基本一致。基因突变类型以单碱基替换为主。这些复发的患者在初诊时每例检测到1-4个基因突变,发生频率最高的是C-KIT (6/11),包括D816 (exon17)突变3例(其中,D816Y、D816H、D816V各1例),N822(exon17)突变1例,M541 (exon10) 1例,R815_D816ins (exon17)1例；ASXL1、MLH1和TET2突变各2例；FBXW7、DNMT3A、NRAS和DNMT3B突变各1例。复发时,原有的6例C-KIT突变仅有4例仍然存在,2例丢失；新获得了KIT P665突变1例,KITP665、KIT N822突变1例。与初次诊断时相比,复发时有5例患者的基因突变模式未发生变化,6例发生了变化,其中新获得的基因包括KMT2A、C-KIT、TET2和SH2B3,丢失的原有基因包括C-KIT和NRAS。分别有2例患者在复发时获得了KMT2A、C-KIT、TET2突变,1例获得了SH2B3突变；2例患者复发时丢失了C-KIT,1例丢失了NRAS。3、Sanger测序结果及其验证为了验证NGS测序结果的可靠性,用Sanger方法测序检测了所有标本的C-KIT外显子8、17的突变情况。在初次诊断标本中检测出17外显子突变5例(D816 3例,N822 1例,R815_D816insl例),复发标本检测出17外显子突变3例(D816、N822和R815_D816ins各1例),未检测出8号外显子突变,结果显示两种方法的一致性为100%。4、重现性突变的MLH1致病性测序结果测序结果显示,有2例患者在初次诊断和复发时均出现MLHlc.1151TA突变,在本研究第一部分正常核型AML患者的基因突变谱中,也检测出3例患者携带该突变,因此对该突变的原始结果进行了仔细分析,该位点的测序深度均在100X以上,均为杂合突变,位于其扩增子的中间部位。三款软件来预测该突变位点的致病性,polyphen-2预测的得分为0.998,为probably damaging; mutationtaster预测的结果为disease causing; MAPP-MMR预测的得分为5.120(得分大于4.55为具有致病性)。结论1、本研究采用Ion Torrent PGMTM测序平台,在原有商业化实体肿瘤基因突变试剂盒的基础上成功加载了对AML预后具有预测价值的17个基因,经过27例染色体核型正常的AML患者样本的检测以及与经典的测序方法比较,结果证明成功的建立了一套灵敏特异、可靠、高通量的AML突变检测方法。2、Ion Torrent PGMTM在长片段插入或缺失和单个碱基出现多次重复(即Homopolymer)区段的检测中还有一定的缺陷。3、在动态研究初次诊断和缓解后复发的伴有t(8；21)染色体核型异常的AML患者中,发现大部分患者出现了与初次诊断时不同的基因突变模式,其中C-KIT基因突变为最常见类型。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R733.71;R440
【部分图文】：

预后良好的优越性只有在ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＭＬＸ－ＰＴＤ、ＤＮＭＴ３Ａ等基因没有突??变的情况下才能显现出来［４］。总之，ＡＭＬ中各种基因突变并不是单独存在，而??且不同组合有不同的临床意义（图１－１）?［３］，因此临床医生需要更为详尽的基因??突变谱，采用不同基因突变的组合去判断疾病的预后、指导个体化治疗。??图１－１?ＡＭＬ患者各种基因突变发生频率及基因突变共发生情况??Ｆｉｇ?１－１?Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ?ａｎｄ?ｐａｉｒｗｉｓｅ?ｃｏ－ｏｃｃｕｒｒｅ打ｃｅ?ｏｆ?ｍｕｔａｔｉｏｎｓ?ｉｎ?ＡＭＬ??２??

Ｆｉｇ?１－２?Ｗｏｒｋ円ｏｗ?ｏｆ?Ｉｏｎ?Ｔｏｒｒｅｎｔ??（法ｉ?１、脱氧核巧酸分子流过忍片微孔；２、若脱氧核巧酸与微孔中的ＤＮＡ分子互补，??该核巧酸被即合成到ＤＮＡ分子中，同时释放氨离子，使该孔溶液的ＰＨ值发生变化；３、??感应层检测到ＰＨ变化；４、感应层将ＰＨ变化的化学信息转变为电压变化信息；５、电压??变化信息转变为数字电子信息。如果ＤＮＡ链含有两个相同的碱基，则记录电压信号是双??倍的。如果碱基不匹配，则无氨离子释放，也就没有电压信号的变化。）??Ｉｏｎ?Ｔｏｒｒｅｎｔ是目前世界上唯一使用半导体芯片测序的高通量测序仪，仪器??硬件无需激光等激发光源和ＣＣＤ等光学检测设备，配套试剂也无需巧光标记和??焦磯酸酶化学级联，仅使用未经修饰的核昔酸和聚合酶等天然试剂，直接实时??检测ＤＮＡ聚合时产生的Ｈ＋离子流ＰＨ值变化，实现了简单真实的生物化学原??理。具有出色的测序覆盖均衡度，因此可使现有第二代测序技术存在的测序数??据偏差（ＧＣ?ｂｉａｓ）降低到前所未有的水平。其应用范围覆盖Ｓａｎｅｒ测序和己有??

２．７．１?Ｓａｎｇｅｒ测序结果??对所有标本的?ＦＬＴ３－ＩＴＤ（ｅｘｏｎｌ４、１５）、ＮＰＭｌ（ｅｘｏｎｌ２）和?ＤＮＭＴ３Ａ（Ｒ８８２??位点附近）进行经典的Ｓａｎｇｅｒ方法测序作为验证，测序结果见图１－９，?Ｓａｎｇｅｒ??测序共检测到；ＦＬＴ３－ＩＴＤ阳性４例，ＮＰＭ１阳性６例，ＤＮＭＴ３Ａ阳性５例。??２７??

本文编号：2871813