白细胞介素-18及相关标志物在深静脉血栓形成中的表达变化与作用机理研究

发布时间：2017-04-05 17:20

  本文关键词：白细胞介素-18及相关标志物在深静脉血栓形成中的表达变化与作用机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：课题研究主要就白细胞介素-18、核转录因子-κB、血管性血友病因子等标志物,在深静脉血栓形成中的作用及相互关系进行实验研究。通过动物造模实验、临床检测及细胞实验等方式,结合分子生物学实验技术手段,就上述关键标志物与深静脉血栓形成的相关机理进行探讨。目的：1、狭窄法进行瘀滞型SD大鼠下腔静脉血栓造模,分组对比不同时间点大鼠下腔静脉血栓形成情况,检测IL-18、NF-κB、vWFGPIb-α等标志物的表达状态；同时在临床患者血液中检测上述指标的变化。结合探讨研究所关注检测指标与DVT的临床联系及意义;2、体外构建有效的IL-18慢病毒过表达载体和逆转录病毒抑制载体,作用HUVECs提取总RNA进行基因芯片分析,观察HUVECs整体功能变化；大鼠尾静脉注谢IL-18过表达／抑制质粒载体病毒并行IVC血栓造模,比较血栓形成情况,检测局部静脉壁IL-18及相关指标的表达变化,进一步讨论过表达／抑制IL-18对血栓形成和下游标志物的影响；3、针对IL-18与内皮细胞功能障碍标志物间的关联性进行实验,深入探讨IL-18影响内皮细胞功能的作用途径,以及该途径对静脉血栓形成造成影响的机理。方法：1、120只SPF级SD大鼠,按随机分组原则分为3组：DVT模型组(n=40)、假手术组(n=40)和对照组(n=40),参考课题组历年研究经验和经典文献报道,在造模后设立2h、8h、24h、72h等不同时间点。每个时间点每组分别取10只大鼠进行解剖对照观察血栓形成情况,ELISA检测血液样本中IL-18、NF-κB、vWF和GPIb-α的表达情况；2、采集筛选临床血样,分为深静脉血栓组患者30例、实验对照组患者20例、正常对照组20例,ELISA检测血中IL-18、NF-κB、vWF 和 GPIb-α的表达,对照动物造模结果进行初步探讨；3、构建人和大鼠IL-18慢病毒过表达载体和逆转录病毒抑制载体,real-time PCR、Western blot等方法对过表达／抑制效率进行检测；提取IL-18过表达／抑制后HUVECs的总RNA进行基因芯片分析,观察过表达／抑制IL-18对静脉内皮细胞正常功能的影响；4、将两种载体转染至宿主细胞293T后所产生的病毒,分别通过大鼠尾静脉注射的方式对实验动物进行分组预处理；大鼠DVT造模后对IVC血栓段组织进行取材,对血栓形成情况进行对比,real-time PCR、Western blot检测静脉壁组织中IL-18及相关基因的表达变化；5、体外培养HUVECs并添加外源性IL-18进行预处理,通过real-time PCR、 Western blot、免疫荧光、流式细胞仪等手段,检测IL-18是否通过激活NF-κB介导的细胞信号通路,对HUVECs存活状态和vWF、P-selectin、t-PA等内皮细胞功能标记物表达产生影响,结合前期实验结果对DVT发生机理进行综合分析。结果：1、利用狭窄法可成功制作瘀滞型SD大鼠IVC血栓模型,狭窄法残余管腔横截面积比控制在10%左右可得到良好成栓率、成活率;造模后8h开始有完全性血栓形成,24h血栓形成稳定；2、IL-18、NF-κB、vWF和GPIb-α等ELISA检测结果示：大鼠造模后血中蛋白检测随血栓的发生、发展逐渐呈现高表达,24h(病检显示为血栓形成高峰期)各指标明显上调(P0.05)；临床下肢深静脉血栓患者,血液中相关蛋白表达高于无DVT的健康人和血栓高危因素患者(P0.05),各指标表达基本符合动物造模表达情况；3、利用慢病毒载体和逆转录病毒载体,可成功构建高效的IL-18基因过表达／抑制载体；基因芯片检测发现IL-18过表达可对HUVECs正常生理功能产生明显影响,并出现大量的差异表达基因；而抑制IL-18表达可产生不同效应；4、IL-18过表达慢病毒和IL-18抑制逆转录病毒,预处理大鼠行DVT造模后各组血栓形成的重量、质量和重量／质量比等指标,均显示IL-18的表达变化对深静脉血栓形成有明显影响(P0.05)；造模段静脉组织中NF-κB和vWF的基因和蛋白表达水平,均随IL-18表达变化出现调控性改变；5、IL-18可激活HUVECs中NF-κB介导的细胞信号转导通路,使HUVECs损伤及早期凋亡现象明显增多；促使内皮细胞标志物vWF、P-selectin发生表达上调、t-PA合成产生量明显减少。结论：1、炎性反应和内皮细胞功能相关标志物：IL-18、NF-κB、vWF、P-selectin、t-PA与深静脉血栓形成的发生、发展过程相关；2、IL-18高表达可使]HUVECs存活状态及凋亡异常,选择性抑制NF-κB激活可明显减少该途径所致的细胞损伤；3、IL-18介导内皮损伤可促使vWF、P-selectin表达上调、t-PA合成量明显减少,导致静脉易栓性；4、IL-18调控NF-κB引起的内皮细胞炎性损伤和功能异常,可能是深静脉血栓形成的相关机理之一。
【关键词】：白细胞介素18 核转录因子κB 血管性血友病因子 血小板膜糖蛋白Ibα 深静脉血栓形成 静脉内皮细胞 炎症反应
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.6
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 中英文符号说明13-17
• 前言17-19
• 第一部分：深静脉血栓形成中IL-18及相关标志物的表达及意义19-69
• 研究一 大鼠深静脉血栓模型IL-18、NF-κB、vWF及GPIb-α的表达变化19-45
• 一、材料和方法19-37
• 二、结果37-45
• 研究二 下肢深静脉血栓患者IL-18等标志物的表达与意义45-59
• 一、研究对象和方法45-54
• 二、结果54-59
• 讨论59-68
• 结论68-69
• 第二部分：过表达/抑制白介素-18在深静脉血栓形成中的作用69-129
• 研究一 IL-18过表达/抑制载体构建及对静脉内皮细胞的功能影响69-106
• 1 实验设备及材料69-72
• 2 实验方法72-86
• 3.结果86-106
• 研究二 过表达/抑制IL-18对大鼠深静脉血栓形成的影响106-122
• 1.实验设备及材料106
• 2.实验方法106-115
• 3.结果115-122
• 讨论122-128
• 结论128-129
• 第三部分：IL-18激活NF-κB影响细胞信号转导对静脉内皮细胞的作用129-154
• 1 实验材料及设备129-130
• 2 实验方法及步骤130-137
• 3 结果137-148
• 讨论148-153
• 结论153-154
• 参考文献154-163
• 附录-1163-165
• 附录-2165-166
• 附录-3166-176
• 论文相关综述176-185
• 参考文献181-185
• 攻读学位期间基本情况185-186
• 致谢186

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张鹏;施海彬;刘圣;李麟荪;;犬下肢深静脉血栓模型的实验研究[J];介入放射学杂志;2006年05期

  本文关键词：白细胞介素-18及相关标志物在深静脉血栓形成中的表达变化与作用机理研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：287416