腰背痛是临床上常见疾病,成年人中有腰背痛经历的可高达80%,这不仅给患者的生活和工作带来影响,也给家庭和社会带来沉重的负担。目前多项研究表明椎间盘退变与腰背痛关系密切,是引起腰背痛的重要原因。虽然临床上有多种治疗手段可以缓解腰背痛,但目前各种措施都不能从根本上阻断或逆转椎间盘退变。为了解决这一大临床难题,多年来研究者力图探索出有效的生物学治疗方式来达到修复或再生椎间盘的目的,从而能从根本上避免退变性椎间盘疾病的发生。椎间盘退变的生物学治疗措施包括生长因子注射治疗、细胞治疗、组织工程材料植入、基因治疗等。其中,生长因子治疗开展较早、应用广泛,是目前修复或再生椎间盘退变的有效治疗策略。相比于其它几种治疗方法,生长因子疗法操作更方便,技术难度小,更适合于临床大规模应用,具有广阔的研究前景。现已知多种生长因子可以刺激椎间盘内细胞增生、抑制细胞凋亡、刺激细胞外基质合成等等,可对椎间盘退变产生修复作用,但同时也发现,向椎间盘内注射单一的生长因子,它所能发挥的修复作用非常有限。为了增加生长因子的作用效果和持续时间,研究者曾尝试将多种生长因子联合应用,证实其修复作用可以得到增强。而富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)制品作为来源于自体的活性物质,富含各种活性因子,其中多种生长因子具有刺激细胞增殖、增强细胞功能、抑制细胞凋亡等功能,可以改善椎间盘内环境。基于此背景,本研究探索利用自体富血小板血浆释放物(platelet-rich plasma releasate,PRPr)对退变椎间盘的作用效果,以期建立一种可有效修复或再生退变椎间盘的治疗方式。第一部分兔腰椎间盘退变模型的建立和评估研究背景椎间盘退变与腰背痛发病关系密切,探索椎间盘退变的发生及发展机制,寻求高效、安全、经济的治疗方式显得尤为关键。而动物模型是探索疾病发病机制和验证治疗效果的重要工具,尤其是在临床前期研究中起着不可替代的作用。目前退变椎间盘的造模方法大致可分为自发退变和实验诱导两大类。本研究最终目的是探索PRPr对退变椎间盘的修复作用,由于PRPr中富含多种生长因子,潜在修复能力较强,因此本实验选用可诱导出中重度退变的髓核抽吸造模方式,力图模拟人中晚期椎间盘退变过程和表现,为后续治疗性研究做实验准备。目的本部分实验探索通过髓核抽吸法来建立一种可靠的、能模拟人椎间盘退变的动物模型,并对其退变表现建立评估体系,为后续治疗性研究做实验准备。方法选用36只健康新西兰大白兔,随机分为实验组和对照组各18只。实验组用连接10ml注射器的21G针头穿刺进入L4/5、L5/6、L6/7椎间盘内,穿刺深度控制在5mm左右,抽取少量髓核组织,其质量在5～8mg之间。操作结束后,逐层缝合。对照组仅切开显露出椎间盘,不进行穿刺或髓核吸取等操作。两组动物分别于术前、术后1w、2w、4w拍摄腰椎X线片,测量椎间盘高度(Disc Height Index,DHI),计算DHI%表示造模前后椎间盘高度的变化。于术后1w、2w、4w取材后做HE、番红、Masson三色染色,依据评分标准对椎间盘组织形态变化评分;采取ELISA法来测定椎间盘内聚集蛋白聚糖(aggrecan,AGC)和Ⅱ型胶原蛋白(Collagen type Ⅱ,COL Ⅱ)的含量。结果X线结果显示实验组DHI%在术后1w即下降至82.5 7%±6.56%,术后2w和4w分别为80.29%±6.19%和73.25%±8.14%。并且实验组DHI%下降呈逐渐加重的表现。组织切片染色发现,实验组椎间盘髓核皱缩、纤维环排列紊乱或出现裂隙、髓核内细胞数量减少、细胞外基质减少、出现细胞化生。组织学评分结果显示在造模后1w、2w、4w,实验组的组织学评分均出现增高,且随时间延长,实验组椎间盘退变程度逐渐加重。ELISA检测结果显示椎间盘在造模后1w、2w和4w,实验组AGC含量(43.62±4.97ng/g、38.50±5.36ng/g、31.16± 6.95ng/g)和 COL Ⅱ含量(70.42±6.93ng/g、64.99±6.84ng/g、5 5.49±6.2 3 ng/g)均较对照组明显减少,并且实验组二者含量减少呈现逐渐加重的趋势。结论本研究结果表明髓核抽吸法顺利诱导出了兔腰椎间盘退变,术后观察发现造模后椎间盘高度下降、出现椎间盘退变组织学特征、椎间盘内AGC和COLⅡ含量下降,且上述表现持续存在,证明髓核抽吸操作可成功建立兔腰椎间盘退变模型,此动物模型可应用于退变椎间盘的治疗性研究中。第二部分自体富血小板血浆释放物的制备和活性评价研究背景PRP是将血液通过梯度离心等方式分离得到的浓缩产物,其特点是含有高浓度的血小板。作为一种自体来源的生物制剂,PRP已被证实具有促进组织修复和再生的功能。其发挥生物学修复作用的前提是被凝血酶、氯化钙等激活物激活,将含有的各种生长因子释放出来。但是激活后PRP立即转变为凝胶状,不利于注射治疗。PRPr是从激活PRP中提取出来的含有多种生长因子的混合物,它呈现为液体状态,因此可用于椎间盘内注射用。目的本研究即通过三步离心法提取兔PRPr,并对其活性进行测定,为下一步实验做准备。方法选取10只新西兰大白兔。于兔耳中央动脉采取新鲜血液14ml,注射器内已抽取1ml枸橼酸盐以防止发生凝血。将抽取的全血分为三部分:分别取2ml用于测定全血血小板浓度和全血TGF-β 1浓度,剩余置于离心管内制备PRPr。将全血于250g离心10分钟,吸取全部血浆层、白膜层、白膜层与红细胞层交界面以下约2mm处血液成分至另一离心管内。再以1000g进行第二次离心10分钟,去除3/4上清液,保留下方浓缩的血小板和上方剩余的部分血浆,混匀后取约0.2ml PRP进行血小板计数。接下来,向每1ml PRP中加入100μL激活剂(1000U/mL凝血酶和100mM CaCl2),摇匀,从而激活血小板获得凝胶状的激活后PRP,静置3小时,将此凝胶状物1000g离心10分钟,再收集上清液,获取PRPr。利用血细胞分析仪测定全血和未激活PRP中血小板浓度。使用ELISA法测定全血和PRPr中TGF-β 1的浓度。结果正常兔全血中血小板计数为(217.40±51.86)×109/L,PRP中血小板计数为(991.30±107.76)×109/L。血小板回收率为66.80%±11.76%,富集系数为4.72±0.89。本制备方式获取的PRP血小板浓度为正常全血的4.7倍左右。正常兔全血中TGF-β 1浓度为297.86±70.66 ng/L,PRPr中TGF-β 1浓度为 1020.95±219.08 ng/L,为全血的 3.57±0.98 倍。对 PRPr 中 TGF-β1 浓度和其它指标进行相关性分析,统计结果表明全血血小板计数和未激活PRP血小板计数与之呈显著正相关。结论通过三次离心法可以制备出含有高浓度的TGF-β1的PRPr,可满足动物实验或临床应用的要求。PRPr中TGF-ββ1浓度与全血血小板计数或PRP血小板计数呈明显正相关关系,提高PRP中血小板含量有助于获取更高活性的PRPr。第三部分自体富血细胞血浆释放物对兔退变椎间盘的干预作用研究背景目前椎间盘退变性疾病治疗分为保守治疗和手术治疗两大类,但目前的治疗措施都只能缓解患者的疼痛症状,并不能阻止或逆转椎间盘退变。目前比较有潜力的修复措施是采用各种生物制剂,其中就包括各种PRP制品。研究表明PRP对骨缺损、关节软骨退变或损伤、韧带损伤、半月板损伤、肌腱、软组织缺损等均具备一定修复功能。体外实验表明,PRP可有效促进动物椎间盘细胞增殖和细胞外基质代谢。实际临床工作中,常遇到椎间盘严重退变的情况,其生物学治疗更加困难。而髓核抽吸法建立的退变模型能模拟出中重度椎间盘退变的情况。注射PRP释放物是否对中重度的椎间盘退变也有修复效果,目前还缺乏这方面研究。目的本研究采取髓核抽吸法建立兔椎间盘中重度退变模型,然后向椎间盘内注射PRPr和TGF-β1,通过影像学、组织学、免疫学测定等手段来评估PRPr对退变椎间盘的修复效果,同时对PRPr和TGF-β1的修复效果进行比较,以探索更佳的治疗方式。方法72只新西兰大白兔分为4组:PRPr组、TGF-β 1组、PBS组和Sham组(n=18)。通过髓核抽吸法来建立兔椎间盘退变模型,造模2w后再次手术,向退变椎间盘内注射干预剂。前三组分别注射20μL的PRPr、TGF-β 1(1ng/ml)和PBS。Sham组仅进行显露和穿刺,不注射任何药物。在注射前和注射术后1w、2w、4w行腰椎X线检查,测量DHI%以表示椎间盘高度变化。术后1w、2w、4w处死取材,行HE、番红O、Masson染色以便组织学观察,同时通过ELISA法测定椎间盘内AGC及COL Ⅱ含量。结果造模术后2w,4组椎间盘高度DHI%出现明显下降,下降幅度均在20%左右,4组之间DHI%无明显差异。二次手术后2w,相比于PBS组或Sham组,PRPr 组或 TGF-β1 组的 DHI%均明显增加(PRPr 组:88.98±2.97%,TGF-β1组:84.32±3.43%),并且DHI%的增加一直持续到注射后4w(PRPr组:92.15±3.1 1%,TGF-β1 组:86.99±4.94%)。进一步分析得知,PRPr 组 DHI%的提高程度要比TGF-β1组明显。分析不同时间点之间DHI%的区别,显示PRPr组在注射后4w DHI%要比注射后2w时进一步增加,但是TGF-β1组各时间点DHI%却无明显变化。组织学观察结果显示,当向退变椎间盘内注射PRPr或TGF-β1后退变得以不同程度的修复,两组退变椎间盘均有再生表现。髓核逐渐恢复成接近圆形,并且内部逐渐再次出现较大、含滤泡的细胞。番红O染色结果显示髓核内蛋白多糖含量增加,纤维环内成簇状的软骨样细胞增多,并且纤维环内胶原纤维的分布变得较前重新有规则。组织学评分结果表明PRPr组的组织学评分最早在注射后2w开始出现下降,至术后4w其评分进一步下降。而TGF-β1组的组织学评分仅在术后4w时评分下降才有统计学意义。PRPr组与TGF-β1组相比,在注射后2w和4w组织学评分均更低。ELISA结果证实了 PRPr或TGF-β1具有促进退变椎间盘AGC和COLⅡ合成的作用。注射后1w,与PBS组或Sham组相比,PRPr组AGC和COLⅡ含量均有增加。随着时间延长,至术后2w和4w,其含量增加继续有统计学意义。TGF-β 1组在术后1wAGC含量开始增加,但COL Ⅱ含量增加却延迟至术后2w。结果还显示PRPr组内AGC和COL Ⅱ含量从术后2w开始比TGF-β1组更高,并持续到术后4w。对同一组内不同时间点AGC和COL Ⅱ含量进行统计分析,结果显示PRPr组在术后4w含量呈逐渐增加趋势。但TGF-β1组在术后3个时间点的含量无明显差别。而PBS组和Sham组AGC和COL Ⅱ含量均呈现逐渐下降的趋势。结论本研究证实PRPr对退变椎间盘具有修复和再生作用。在髓核抽吸诱发的兔中重度椎间盘退变模型中,将PRPr注射入退变椎间盘后,椎间盘高度、组织学形态、细胞数量、细胞外基质含量等均被证实明显改善。并且,PRPr对兔退变椎间盘的修复效果在作用强度和持续时间上均优于单独注射TGF-β1,这提示PRPr内多种生长因子共同对退变椎间盘发挥了修复作用。PRPr具有安全性高、制备方便、效果强的优势,为将来临床上治疗DDD提供了一种有力选择。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R681.5
【部分图文】：
图２－ｌ?ＰＲＰｒ的制备过程
?山东大学博士学位论文???明显正相关，但是ＰＲＰｒ中ＴＧＦ－Ｐ１浓度和全血ＴＧＦ－Ｐ１浓度、血小板回收??率或富集系数之间无相关关系。??对ＰＲＰ和全血的血小板计数进行相关性分析，结果显示二者呈正相关??（ｒ＝０．７４６，Ｐ＝０．０丨３）。对血小板回收率和富集系数之间进行相关性分析，结??果显示二者呈正相关（ｒ＝０．６４９，?Ｐ＝０．０４２）。??表２－３?ＰＲＰｒ中ＴＧＦ－Ｐ?１浓度和其它指标的相关性分析??ｒ?ｒ??令血丨［ＩＩ?小?Ｗ?ＵＳ?０．８１３?０００４??ＰＲＰ?血小拟?ｉＫ＆?０．７８０?０?００８??令血?ＴＧＦ－［Ｍ?浓?Ｕ?０．２４９?０?４８９??血小板冋收卞？?０．４５５?０．１８７??ｆｆｌＬ小板这锵系数?０．４７５?０．１６５??４００－．??％?？??Ｉ?３００－??ｌ２〇〇－?卜０．８１３??Ｐ?＝０．００４??＜＋１?？??１００■??Ｉ?ｉ?＼?ｉ?Ｉ??６００?８００?１０００?１２００?１４００?１６００??ＴＧＦ－ｐ?１（ｐｇ／ｍｌ）??图２－２?ＰＲＰｒ中ＴＧＦ－Ｐ?Ｉ浓度与全血血小板计数的相关性分析。结果表??明二者呈显著正相关关系，ＰＲＰｒ中ＴＧＦ－Ｐ１浓度随全血血小板计数增高而??增加。??５７??
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