雄芍汤干预DMN诱导大鼠肝纤维化的代谢组学研究

发布时间：2017-04-06 18:03

  本文关键词：雄芍汤干预DMN诱导大鼠肝纤维化的代谢组学研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分雄芍汤有效成份的含量测定目的通过对雄芍汤中粗多糖、总苷、总生物碱三个主要有效成份的含量进行测定,保证雄芍汤药物质量可靠。方法雄芍汤采用常规水煎煮法作为提取方法。粗多糖分离采用醇沉法,除蛋白杂质采用Sevage法;总苷分离采用水饱和正丁醇萃取法;总生物碱分离采用氨水乙醚冷浸法。雄芍汤粗多糖提取物中总多糖的含量测定采用苯酚-硫酸法,总苷提取物中人参总皂苷的含量测定采用香草醛-冰醋酸-高氯酸紫外显色法,雄芍汤总生物碱提取物中总碱的含量测定采用酸性染料比色法。结果粗多糖提取物中总多糖平均含量为541.62 mg/g;总苷提取物中人参总皂苷的含量为642.78mg/g;总生物碱提取物中总碱的平均含量为828.79mg/g。结论雄芍汤中粗多糖、总苷、总生物碱三个主要有效成份的提取方法有效,含量测定符合药效学研究,雄芍汤质量稳定,为下一步动物实验打好药效学基础。第二部分以NMR为基础的DMN诱导大鼠肝纤维化模型代谢组学研究目的通过二甲基亚硝胺(DMN)诱导建立大鼠肝纤维化模型,基于核磁共振技术(NMR)技术寻找大鼠尿液及血清中潜在的代谢物分子,对模型大鼠肝脏组织进行代谢组学研究,为肝纤维化诊断提供一种新的无创性诊断方法。方法将52只SD雄性大鼠,采用随机法分为正常对照组(以下简称为正常组)12只及肝纤维化模型组40只。给模型组大鼠腹腔注射DMN制备肝纤维化模型,按1ml/kg剂量注射1%DMN,隔日1次,每周3次,连续4周,正常组大鼠腹腔注射等量生理盐水。造模期间,模型组大鼠意外死亡7只。造模成功后,随机抽取模型组大鼠6只、正常组大鼠6只取材。采用代谢笼收集正常组、模型组的24小时尿液后处死取材。观察大鼠一般情况和新鲜肝脏;送检血清肝功能指标三项和血清肝纤维化标志物四项;HE染色观察肝组织病理学改变;基于NMR分析技术对模型大鼠和正常大鼠尿液及血液样本进行测定分析,采用SIMCA-P软件进行多元统计分析,找寻DMN诱导大鼠肝纤维化代谢损伤标志物。结果对正常组和模型组的尿液图谱进行PCA分析显示,模型组与正常组可明显区分,正常组样本大多位于PC1的负半轴,而模型组大多位于PC1的正半轴,说明通过肝纤维化造模后,模型组动物的尿液组成发生了较大变化。模型组大鼠尿液中苯乙酰甘氨酸、马尿酸、胍基乙酸含量降低,而牛磺酸、丁酸盐、琥珀酸盐、N-乙酰天冬氨酸、2-羟基丁酸盐含量升高。对正常组和模型组大鼠血清的CPMG谱进行了主成分分析,正常与模型大鼠可明显区分,与正常组相比,模型组中羟基丁酸、乳酸、醋酸、谷氨酸含量升高;β-葡萄糖、α-葡萄糖含量降低。对正常和模型大鼠led谱的主成分分析结果显示,肝纤维化模型大鼠的大分子物质也发生了改变。与正常组相比,模型组大鼠血清中HDL-CH3、N-乙酰葡萄糖胺、丙酮、-N(CH3)3、Lipid-CH=CH-升高;Lipid-CH2CH2CO、Lipid-CH2CH=、Lipid-CH2CO-、Lipid=CHCH2CH=、磷脂酰胆碱降低。结论我们在动物模型中寻找到这些代谢标志物,它们的变化趋势反应了肝纤维化模型多种代谢功能失调,如氨基酸、脂肪酸和葡萄糖等代谢紊乱,有很大潜能来作为肝纤维化的早期无创诊断线索。第三部分雄芍汤对DMN诱导大鼠肝纤维化模型尿液及血清代谢损伤标志物的干预目的应用代谢组学平台分析雄芍汤干预肝纤维化模型大鼠代谢损伤标志物的变化趋势。进一步阐明雄芍汤具有良好的抗大鼠肝纤维化作用。方法造模成功的第2天开始,模型组剩余27只大鼠平均分为3组,模型组9只,雄芍汤组9只,扶正化瘀组9只。给扶正组9只;雄芍组9只分别灌胃相应的雄芍汤水煎剂和扶正化瘀胶囊,给药剂量分别以成人临床剂量,推算出人每公斤体重用量,根据体型系数换算成大鼠用量。每日灌胃一次,连续4周。同时正常组及模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃,每日一次,连续4周。给药结束后,采用代谢笼收集雄芍组、扶正组、模型组、正常组的24小时尿液后处死取血、取肝。基于NMR分析技术对雄芍组大鼠、扶正组大鼠、模型组大鼠和正常组大鼠的尿液及血液样本进行分析测定,同时采用SIMCA-P软件进行统计分析,探寻各组大鼠代谢损伤标志物的变化趋势。结果PCA分析显示,正常组位于PC1的负半轴,而模型组大多位于PC1的正半轴,扶正组和雄芍组位于正常和模型组的中间,说明药物干预后体现出明显的治疗作用,但尚未回归到正常状态;此外,扶正组和雄芍组无明显区分,说明从尿液代谢物的角度来看,两组的治疗效果接近。尿液代谢谱苯乙酰甘氨酸、胍基乙酸在模型组含量降低,给药后扶正组和雄芍组均可使其含量升高,呈现回归趋势;琥珀酸盐、丁酸盐、2-羟基丁酸盐在模型组中含量升高,给予扶正化瘀胶囊和雄芍汤后含量均降低,其中雄芍组可使三者均回归至接近正常水平,而扶正只能使2-羟基丁酸盐回归至正常水平,说明二者的治疗效果和作用机制有所不同。对正常组、模型组、扶正组、雄芍组的血液小分子物质核磁谱进行了PCA分析显示,可见正常组位于PC1的负半轴,而模型组大多位于PC1的正半轴,扶正组和雄芍组位于正常和模型组的中间,说明药物干预后体现出明显的治疗作用,但尚未回归到正常状态;此外,雄芍组更接近正常组,说明从血清代谢物的角度来看,雄芍组的治疗效果略好。α-Glucose和β-Glucose在模型组含量降低,给药后扶正组和雄芍组均可使其含量升高,即呈现回归趋势,雄芍组回归趋势优于扶正组;谷氨酸在肝纤维化模型组中含量升高,给予扶正化瘀胶囊和雄芍汤后其含量均降低,说明雄芍组和扶正组使其呈现回归趋势,且雄芍回归趋势效果优于扶正组。对正常、模型、扶正、雄芍组血液大分子物质的PCA分析结果显示,正常组与模型组可区分,雄芍组与正常组重叠,但扶正组位于模型组上方,且远离正常组,因此,从血液大分子物质的PCA分析结果来看,雄芍组体现出较好的治疗效果,扶正组作用不明显。结论雄芍汤能有效改善大鼠肝纤维化损伤标志物代谢成分,使其回归正常。雄芍汤抗肝纤维化作用,主要体现在对肝脏糖代谢及氨基酸代谢的有效干预。
【关键词】：雄芍汤 代谢组学 大鼠 肝纤维化 二甲基亚硝胺
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 摘要8-12
• ABSTRACT12-19
• 英文缩略词表19-20
• 前言20-23
• 参考文献22-23
• 第一部分 雄芍汤有效成份的含量测定23-30
• 1 材料23-24
• 1.1 药物与试剂23
• 1.2 仪器23-24
• 2 方法及结果24-28
• 2.1 雄芍汤粗多糖的提取和含量测定24-26
• 2.1.1 雄芍汤粗多糖的提取24-25
• 2.1.2 雄芍汤粗多糖的含量测定25-26
• 2.1.2.1 对照品溶液的制备25
• 2.1.2.2 供试品溶液的制备25
• 2.1.2.3 标准曲线的绘制25
• 2.1.2.4 样品的测定25-26
• 2.2 雄芍汤总生物碱的提取和含量测定26-27
• 2.2.1 雄芍汤总生物碱的提取26
• 2.2.2 雄芍汤总生物碱的含量测定26-27
• 2.2.2.1 供试品溶液的制备26
• 2.2.2.2 测定方法26
• 2.2.2.3 样品的测定26-27
• 2.3 雄芍汤总苷的提取和含量测定27-28
• 2.3.1 雄芍汤总苷的提取27
• 2.3.2 雄芍汤总苷提取物中人参总皂苷的含量测定27-28
• 2.3.2.1 对照品溶液的制备27
• 2.3.2.2 供试品溶液的制备27
• 2.3.2.3 样品的测定27-28
• 3 讨论28-29
• 3.1 供试品溶液提取工艺的选择28
• 3.2 测定方法的选择28-29
• 参考文献29-30
• 第二部分 以NMR为基础的DMN诱导大鼠肝纤维化模型代谢组学研究30-53
• 1 材料30-31
• 1.1 实验动物30
• 1.2 试剂30-31
• 1.3 实验仪器31
• 2 方法31-33
• 2.1 造模31-32
• 2.1.1 肝纤维化模型制备31
• 2.1.2 动物分组31-32
• 2.2 动物标本获取和处理32-33
• 2.2.1 血清制备32
• 2.2.2 肝脏组织处理32
• 2.2.3 尿样收集方法和处理方法32-33
• 2.3 观测方法及指标检测33
• 2.3.1 症状观察33
• 2.3.2 组织病理学检查33
• 2.3.3 血清学指标检测33
• 3 结果33-47
• 3.1 大鼠的一般情况33-34
• 3.2 肝功能指标的检测34
• 3.3 肝纤维化标志物的检测34
• 3.4 肝组织形态学观察34-35
• 3.5 尿液代谢组学分析35-40
• 3.5.1 尿液处理方法35-36
• 3.5.2 NMR分析条件36
• 3.5.3 NMR图谱预处理36
• 3.5.4 尿液代谢组学数据分析结果36-40
• 3.5.4.1 尿液代谢物指认36-38
• 3.5.4.2 尿液样本中潜在生物标志物的寻找38-40
• 3.6 血清代谢组学分析40-47
• 3.6.1 血清样本处理40-41
• 3.6.2 NMR分析条件41
• 3.6.3 NMR图谱处理41
• 3.6.4 血清代谢组学分析结果41-47
• 3.6.4.1 血清代谢物指认41-43
• 3.6.4.2 血清中小分子物质谱（CPMG）中生物标志物的确定43-45
• 3.6.4.3 血清中大分子物质谱（LED）中生物标志物的确定45-47
• 4.讨论47-51
• 4.1 造模方法的选择47
• 4.2 样品的采集47-48
• 4.3 目前诊断肝纤维化常规指标及缺陷48
• 4.4 尿液代谢物分析48-49
• 4.5 血清代谢物分析49-50
• 4.6 代谢组学实验指标对肝纤维化诊断的意义50-51
• 参考文献51-53
• 第三部分 雄芍汤对DMN诱导大鼠肝纤维化模型尿液及血清代谢损伤标志物的干预53-71
• 1 材料53-54
• 1.1 动物53
• 1.2 试剂与实验仪器53-54
• 1.3 药物54
• 2 方法54-55
• 2.1 分组给药54
• 2.2 样品采集54-55
• 2.3 尿样处理方法55
• 2.4 血清处理方法55
• 3 结果55-64
• 3.1 大鼠的一般情况55-56
• 3.2 肝功能指标的检测56
• 3.3 肝纤维化标志物的检测56
• 3.4 肝组织形态学观察56-57
• 3.5 尿液代谢组学分析结果57-60
• 3.6 血清代谢组学分析结果60-64
• 4 讨论64-70
• 4.1 雄芍汤提出的中医理论依据及方药分析64-67
• 4.2 雄芍汤抗肝纤维化的疗效分析67-68
• 4.3 雄芍汤抗肝纤维化的代谢组学研究68-70
• 参考文献70-71
• 结语71-72
• 附录一 肝脏的物质代谢及中医抗肝纤维化的治疗进展72-86
• 附录二 读博士期间发表论文、科研情况86-87
• 致谢87

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本文编号：289355