不同药物干预心、肾缺血再灌注损伤的作用与机制研究

发布时间：2017-04-08 20:18

  本文关键词：不同药物干预心、肾缺血再灌注损伤的作用与机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：缺血所引起的重要功能器官损伤是致死性疾病的主要原因,诸如心肌梗死、脑卒中、肝肾衰竭等。通过治疗手段使血液灌注恢复后,缺血器官功能代谢障碍及结构破坏不但未减轻反而加重的现象称为缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury, I/R)。长期以来,缺血再灌注损伤一直是临床治疗的难点和热点,但近年来临床治疗方法一直没有明显进步。我们在实验室前期研究的基础上,建立了心、肾缺血再灌注损伤动物和细胞模型,观察了骨骼肌分泌的小分子代谢调节功能蛋白——鸢尾素(Irisin)、直接肾素抑制剂——阿利吉仑(Aliskiren)、D2类多巴胺受体D3亚型激动剂——PD128907对于缺血再灌注损伤的治疗作用,从不同的切入点探讨了氧化应激的调节与I/R损伤治疗的关系,研究结果可能促进缺血再灌注损伤治疗的相关理论研究。具体分三部分阐述。第一部分鸢尾素对心肌缺血再灌注损伤的作用和机制研究研究背景：缺血预适应最早在1986年由美国学者Murry发现,简言之就是对人体进行短暂的、重复的、无创性的的缺血刺激,能够激发体内的应急机制,激活内源性保护机制,释放内源性保护物质,增加了重要脏器的缺血耐受能力,缓解随后更长时间缺血缺氧造成的损伤。经过多年的研究和发展,发现不但器官自身可以诱导缺血预适应,不同器官之间也存远隔缺血预适应(Remote ischemic preconditioning, RIPC)现象,即对某器官诱导缺血预适应,保护作用可惠及全身的其他脏器,其作用机制非常复杂,涉及神经、内分泌等诸多因素。骨骼肌的分泌功能与重要疾病以及寿命的关系是近年来研究的热点问题。最近的研究发现运动可刺激骨骼肌释放一种小分子蛋白——鸢尾素,可以通过激活线粒体功能,燃烧脂肪,调节能量代谢,被认为是治疗代谢性疾病的潜在靶点。同时,骨骼肌又是缺血预适应临床应用的主要效应器官。经外周肢体诱导的RIPC是经过众多临床实验验证并推荐的抵抗缺血再灌注损伤的重要临床治疗手段,日益受到临床重视。那么,揭示骨骼肌的内分泌因素与RIPC的联系可能促进这一重要治疗方法的理论研究和应用发展,为相关药物研发提供理论依据。本研究中,我们以心肌缺血再灌注损伤的动物模型和细胞模型为研究对象,用TTC染色、B超、免疫组织化学、免疫印迹、免疫共沉淀、细胞凋亡检测、激光共聚焦、SOD活性检测、线粒体膜电位检测等实验方法观察了鸢尾素的心肌保护作用,探讨了其保护机制与SOD2、线粒体、氧化应激调节之间的联系。鸢尾素的释放可能是骨骼肌RIPC心肌保护作用的重要内分泌机制之一。目的：揭示肌源性因子——鸢尾素对急性心肌缺血/再灌注损伤保护作用及机制。方法：1.在体研究,采用缺血45min再灌注24h诱导大鼠心肌急性缺血/再灌注损伤模型。鸢尾素在再灌注前即刻给予,以评估心肌保护作用。大鼠处死前,超声测定观察心脏的结构和功能；处死后留取血液样本检测心肌损伤标志物,以进一步确定心肌保护作用。TTC染色观察心肌梗死面积；TUNEL法评价组织的细胞凋亡率；心脏标本留取用于检查细胞凋亡和氧化应激水平,以观察鸢尾素预处理对心肌坏死、凋亡、氧化应激的影响,以探索其可能机制。2.体外研究,以H9c2细胞为观察对象。细胞培养上清液中LDH释放水平和细胞存活率被用来评估鸢尾素预处理对细胞缺氧/复氧损伤模型的保护作用。免疫荧光染色观察亚细胞细胞器中鸢尾素的定位；DCFH-DA荧光探针用于检测细胞内ROS的生成水平；测量线粒体膜电位以评估线粒体功能；应用免疫印迹法检测超氧化物歧化酶家族和鸢尾素的共定位及表达；用透射电子显微镜观察亚细胞器超微结构的变化,以探讨鸢尾素保护作用的可能机制。3.采用大鼠左股动脉无创动脉夹夹闭5min,开放5min,5个循环的方法进行远隔缺血预适应处理。免疫印迹法和ELISA方法检测远隔缺血预适应刺激后血清鸢尾素浓度。通过免疫组化染色确定心肌组织中鸢尾素的分布。结果：1. RIPC恢复了I/R损伤后血清鸢尾素的浓度并增高了鸢尾素在心肌组织损伤区的表达。2.动物模型研究显示,静脉注射外源性鸢尾素可以剂量依赖性的减少心肌缺血再灌注损伤模型的心肌梗死面积,下调心肌损伤标志物肌钙蛋白I(cTnI)和肌酸激酶(CK)的血清水平,降低乳酸脱氢酶(LDH)活性,与溶剂对照I/R组相比差异显著(P0.05)。鸢尾素也改善了心功能,恢复了I/R组大鼠左室射血分数(LVEF),与溶剂对照I/R组相比差异显著(P0.05)。给药前对鸢尾素进行高温处理或者用抗体(抗体：鸢尾素=5：1)中和可以消除鸢尾素的心肌保护作用。鸢尾素治疗I/R组,心肌细胞凋亡信号转导通路关键蛋白(casepase 3和Bax)的表达和活性,以及氧化应激指标(MDA, MPO)都显著降低,而抗凋亡蛋白(Bcl-2)的表达和超氧化物歧化酶(SOD)的活性都明显恢复,与溶剂对照I/R组相比差异显著(P0.05)。3.鸢尾素预处理呈剂量依赖性预防无氧/复氧损伤诱导的细胞死亡,保护细胞的完整性,并抑制细胞内ROS的产生。鸢尾素处理促进了和线粒体SOD2的共定位,升高线粒体膜电位,改善线粒体功能。电子显微镜观察表明,鸢尾素可以增加细胞中的线粒体数量,减轻无氧/复氧损伤引起的线粒体超微结构破坏。结论：1.骨骼肌分泌的功能小分子蛋白——鸢尾素具有心肌保护作用。2.其主要保护机制可能与鸢尾素通过向线粒体转位,抑制线粒体SOD2降解,减少氧化应激,抑制Bax凋亡蛋白表达,抑制凋亡通路关键激酶Caspase3的活性,减少心肌细胞凋亡,可能是鸢尾素心肌保护的主要机制。3.肢体远隔缺血预适应(RIPC)可以诱导循环中鸢尾素含量增加,血浆鸢尾素可向受损心肌转移,鸢尾素可能是介导骨骼肌远端缺血预适应保护的重要内源性媒介之一。提示鸢尾素可能是应激条件下参与病理性氧化应激再平衡的重要内源性因素。第二部分阿利吉仑对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用研究背景：全身和局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活已被证明参与了器官I/R损伤,因此针对该系统各个反应环节的治疗药物开始广泛应用于I/R损伤临床治疗。据报道,直接肾素抑制剂(Direct rennin inhibitor, DRI,如阿利吉仑(Aliskiren))参与了心、脑等重要器官I/R损伤的保护作用,有望成为针对RAAS这一重要干预靶点的临床干预方法之一。肾脏是一个受到全身和局部RAAS调节影响较多的重要脏器,Aliskiren的作用仍有待检验。为丰富和完善直接肾素抑制剂I/R损伤治疗应用的理论依据,本研究中我们以肾I/R损伤模型评估了直接肾素抑制剂对肾I/R损伤的影响,并初步探讨了其机制,结果发现其保护作用可能与抑制血管紧张素Ⅱ (AngiotensinⅡ, AngⅡ)的生成和调节氧化应激有关。Aliskiren的早期干预可能是应对肾I/R损伤后RAAS异常激活的可行方法。目的：评估直接肾素抑制剂——阿利吉仑在急性肾缺血/再灌注损伤模型中的作用和探讨可能的机制。方法：通过构建单一左肾缺血45min/再灌注24h的大鼠肾缺血再灌注损伤模型,观察阿利吉仑预处理(缺血前15min)对肾功能、病理变化、血浆血管紧张素Ⅱ水平、细胞凋亡、氧化应激水平和炎症的影响,以评估其肾I/R损伤保护作用及与凋亡、氧化应激、炎症的关系。结果：与假手术组相比,血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)在I/R大鼠显著增加,伴有肾组织病理学损伤,包括肾小管上皮细胞肿胀、脱落和栓塞的形成,证明单肾缺血再灌注损伤模型构建成功。与假手术组大鼠相比,I/R组有更多的凋亡细胞和白细胞浸润。阿利吉仑预处理减轻了I/R损伤诱导的肾损伤,降低血清肌酐和尿素氮水平,改善肾组织学病理变化,降低肾小管细胞凋亡和白细胞浸润,降低了血浆血管紧张素Ⅱ水平。I/R损伤也减少了超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(还原型GSH)的水平,可被阿利吉仑预处理逆转。结论：1.直接肾素转化酶抑制剂——阿利吉仑(Aliskiren)的预防性应用可以有效拮抗大鼠肾缺血再灌注损伤,并减少肾脏上皮细胞的坏死和凋亡,保护了靶器官功能,减轻了继发炎症反应。其机制可能与抑制局部和全身RAS系统激活,降低AngⅡ合成,抑制氧化应激反应有关。第三部分多巴胺D3受体激活促进与Ga12连接上调减轻肾缺血/再灌注损伤研究背景：众所周知,G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors, GPCRs)是疾病研究的重要热点之一。以AT1R、ETA、肾上腺素能ARa1受体和蛋白酶受体PAR1等为代表的GPCRs广泛参与了I/R损伤时ROS的调控。近年来研究发现,与这些GPCRs偶联的G蛋白亚家族Gα12/13是介导I/R损伤时ROS相关信号的一个关键分子。我们在之前的研究中发现,肾脏多巴胺D3受体在肾脏局部可能通过锚定Ga12,发挥抑制AT1R和ETA的功能,故推测这种作用可能参与了I/R损伤时ROS的调节。在本研究中,我们拟使用大鼠肾I/R损伤在体研究模型和大鼠的肾上皮细胞系(NRK-52E)模型的体外研究模型,以调查激活多巴胺受体D3受体,增加多巴胺受体D3受体和G蛋白a12亚基之间的连结对肾缺血再灌注损伤的保护作用以及对氧化应激的影响。目的：研究多巴胺受体D3R激动剂PD128907诱导的多巴胺受体D3R和G蛋白α12亚基之间的交互作用对急性肾缺血/再灌注损伤和NRK-52E细胞缺氧复氧损伤的作用和机制。方法：1.在体研究,动物模型构建方法同第二部分。多巴胺受体D3R激动剂PD128907(0.2mg/kg, iv),或溶剂对照,在诱导缺血(或缺氧)前15分钟给药。收集血液和肾脏标本检查肾功能,细胞凋亡和氧化应激水平,以及多巴胺受体D3R和G蛋白a12亚基之间的共连接水平。2.体外研究,通过检测G蛋白α12亚基过表达的NRK52E细胞的细胞生存率和培养上清液中LDH释放水平来评价PD128907预处理对H/R损伤的影响。结果：1.多巴胺受体D3R激动剂PD128907预处理可减轻大鼠单肾缺血再灌注损伤。PD128907预处理能增加肾谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的水平；降低MDA水平；使促炎因子TNF-a和IL-1p下调,抗炎因子IL-10p上调,髓质过氧化物酶活性降低；与此结果平行,肾小管上皮细胞凋亡的生物标志物的表达和活性都下调。2.PD128907预处理还促进了I/R损伤后多巴胺受体D3R和G蛋白a12亚基之间的共连接水平增加。3.细胞模型的研究表明,NRK-52E细胞过表达G蛋白a12亚基减弱了PD128907对H/R损伤的保护作用。结论：1.多巴胺受体D3亚型激动剂PD128907的预防性应用同样可以降低大鼠肾缺血再灌注损伤模型,相应减少肾脏上皮细胞的坏死和凋亡,减轻了继发炎症反应,改善远期生存率。该结果在NRK-52E细胞缺氧复氧损伤模型中也得到验证。2.其机制可能与锚定传递胞外氧化应激损伤信号的重要G蛋白亚基Ga12,阻断损伤性氧化应激信号传递,减轻局部和细胞氧化应激水平有关。
【关键词】：缺血再灌注损伤 心脏 肾脏 鸢尾素 肾素抑制剂 多巴胺受体 G蛋白α12亚基 氧化应激 凋亡
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 缩略语表5-8
• 英文摘要8-15
• 中文摘要15-21
• 第一部分 鸾尾轰对心肌缺血再灌注损伤的作用和机制xO究21-66
• 第一章 前言21-24
• 第二章 远隔缺血预适应对鸢尾素血浆浓度的影响24-35
• 2.1 材料与方法24-29
• 2.2 统计学处理29
• 2.3 结果29-33
• 2.4 讨论33-34
• 2.5 小结34-35
• 第三章 鸢尾素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究35-52
• 3.1 材料与方法35-41
• 3.2 统计学处理41
• 3.3 结果41-49
• 3.4 讨论49-51
• 3.5 小结51-52
• 第四章 鸢尾素对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及机制研究52-65
• 4.1 材料与方法52-57
• 4.2 统计学处理57
• 4.3 结果57-63
• 4.4 讨论63-64
• 4.5 小结64-65
• 第一部分结论65-66
• 第二部分 ALISKIREN对肾缺血再灌注损伤的保护作用和机制研究66-83
• 第一章 前言66-68
• 第二章 Aliskiren对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用和机制研究68-83
• 2.1 材料与方法68-71
• 2.2 统计学处理71
• 2.3 结果71-79
• 2.4 讨论79-82
• 2.5 小结82-83
• 第三部分 多巴胺受体D_3R-GA12共连接上调对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的影响和机制研究83-108
• 第一章 前言83-84
• 第二章 多巴胺受体D3型激动剂PD128907对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用研究84-101
• 2.1 材料与方法84-87
• 2.2 统计学处理87
• 2.3 结果87-98
• 2.4 讨论98-100
• 2.5 小结100-101
• 第三章 NRK52E细胞过表达Gα12对多巴胺D_3受体保护作用的影响101-108
• 3.1 材料与方法101-103
• 3.2 统计学处理103
• 3.3 结果103-105
• 3.4 讨论105-107
• 3.5 小结107-108
• 全文结论108-109
• 参考文献109-116
• 文献综述缺血再灌注损伤防治研究进展116-140
• 参考文献133-140
• 攻读博士学位期间发表的学术论文及成果140-143
• 致谢143-144

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 贾丽玲;曹定睿;张维智;李岩;;瑞芬太尼预处理对大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及Bcl-2 Bax表达的影响[J];中国药物与临床;2010年02期

  本文关键词：不同药物干预心、肾缺血再灌注损伤的作用与机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：293612