Akkermansia muciniphila源蛋白酶Amuc-1434对Muc2的降解及其抑制结直肠癌LS174T细胞
发布时间：2020-12-26 16:53
肠道菌群在人类健康和疾病中起着重要的作用。肠黏膜表面的黏膜层是肠细胞与肠道菌群相互作用的场所,对维持肠道健康和肠道微生态平衡至关重要。黏蛋白2（Muc2）是肠黏膜层的主要成分。黏蛋白基因家族中有17个人类黏蛋白基因,根据其不同的结构主要分为分泌型黏蛋白和膜结合型黏蛋白两大类,其中Muc2是第一个被克隆并完全测序的人类分泌型黏蛋白基因,它主要由人结肠和小肠的杯状细胞表达,是小肠和大肠黏液的主要成分。Muc2已被证明是对抗外部病原体的重要保护屏障,与多种癌症疾病相关,如结直肠癌（CRC）、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌。在CRC中Muc2过表达有助于肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫效应分子的识别从而促进CRC的发展。Akkermansia muciniphila是肠道菌群的重要组成部分,具有多种生物学功能,如通过自身的蛋白水解酶调节Muc2的水平。Akkermansia muciniphila利用黏蛋白作为其生长唯一的碳源和氮源,还能产生多种降解黏蛋白的蛋白,但目前尚不清楚哪些蛋白可以降解黏蛋白。本论文工作主要包括三个部分:第一部分,从Akkermansia muciniphila基因库中选择一个编码...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：134 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
Akkermansia muciniphila及其衍生物对宿主代谢的影响[40]
通过MTT法检测重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞生长的影响。本实验中,选择不表达Muc2的人正常黑色素细胞HEM作为对照。将铺板的细胞用不同浓度的重组蛋白Amuc-1434处理24 h,再加入MTT孵育4 h,其检测原理为外源性MTT在活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的作用下还原成蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中,DMSO可以将细胞的沉积物完全溶解,通过酶标仪测OD492 nm即可间接反映活细胞数量。细胞存活率为经重组蛋白Amuc-1434处理的实验组和未经重组蛋白Amuc-1434处理的对照组各自减去空白组后的比值。结果如图4.1(A)所示,重组蛋白Amuc-1434随着浓度的增高,抑制LS174T细胞生长的能力越强。当2μg/mL重组蛋白Amuc-1434处理LS174T细胞后,细胞存活率基本不受影响。当8μg/mL重组蛋白Amuc-1434处理LS174T细胞后,细胞存活率为82%。当64μg/mL重组蛋白Amuc-1434处理LS174T细胞后,细胞存活率为70%。由此可见,重组蛋白Amuc-1434能够抑制LS174T细胞的增殖。在图4.1(B)中,当不同浓度的重组蛋白Amuc-1434处理HEM细胞时,发现HEM细胞的存活率都保证在95%以上,并不受重组蛋白Amuc-1434浓度的影响,由此说明重组蛋白Amuc-1434对人正常黑色素细胞HEM无细胞毒性作用。此外,由于HEM细胞不表达Muc2,因此,重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞增殖的抑制作用可能与其降解Muc2的能力有关。4.4.2 重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞周期的影响
由于在MTT检测实验中8μg/mL重组蛋白Amuc-1434开始对LS174T细胞的增殖有抑制作用,而64μg/mL重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞的增殖有最好的抑制效果,因此在接下来的所有实验中,设置重组蛋白Amuc-1434低浓度组和高浓度组的浓度分别为8μg/mL和64μg/mL,同时设置的对照组不经过重组蛋白Amuc-1434处理。机体对细胞周期的调控作用影响细胞增殖的快慢。反过来,细胞增殖一旦受到影响,也往往表现为细胞周期构成的变化。前面的研究已经证实重组蛋白Amuc-1434影响LS174T细胞增殖,因此我们采用流式细胞术检测重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞周期的影响。图4.2(A)显示经ModFit LT 5.0分析的对照组、低浓度组和高浓度组的细胞周期图。在图4.2(B)和(C)中可以看出,对照组G1期占整个细胞周期的52.97%,低浓度组G1期占整个细胞周期的57.37%,高浓度组G1期占整个细胞周期的63.53%。由此可见,和对照组相比,随着重组蛋白Amuc-1434浓度的增高,LS174T细胞周期的G1期占整个细胞周期的比例增大。因此,重组蛋白Amuc-1434可以诱导LS174T细胞发生G1期细胞周期阻滞。除此之外,我们还检测了重组蛋白Amuc-1434对p53(控制细胞周期启动的肿瘤抑制因子)蛋白表达的影响。结果如图4.3所示,和对照组相比,重组蛋白Amuc-1434处理组中p53蛋白表达上调,并且p53蛋白表达量的变化和重组蛋白Amuc-1434浓度呈正相关。图4.3重组蛋白Amuc-1434对细胞周期启动因子p53蛋白表达的影响
【参考文献】：
期刊论文
[1]Colorectal carcinogenesis:Insights into the cell death and signal transduction pathways:A review[J]. Ashok kumar Pandurangan,Thomas Divya,Kalaivani Kumar,Vadivel Dineshbabu,Bakthavatchalam Velavan,Ganapasam Sudhandiran. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2018(09)
[2]p53 mutations in colorectal cancer-molecular pathogenesis and pharmacological reactivation[J]. Xiao-Lan Li,Jianbiao Zhou,Zhi-Rong Chen,Wee-Joo Chng. World Journal of Gastroenterology. 2015(01)
[3]Colorectal carcinogenesis-update and perspectives[J]. Hans Raskov,Hans-Christian Pommergaard,Jakob Burcharth,Jacob Rosenberg. World Journal of Gastroenterology. 2014(48)
[4]Early stage colon cancer[J]. Hugh James Freeman. World Journal of Gastroenterology. 2013(46)
[5]粘蛋白和上皮钙粘附蛋白在结直肠肿瘤组织中的表达及其意义[J]. 于秀文,荣玮,徐凤琳,徐广有,孙玉荣,冯美燕. 癌症. 2007(11)
[6]线粒体途径在肿瘤坏死因子凋亡诱导配体诱导结肠癌细胞凋亡中的调节作用[J]. 郝继辉,俞鸣,李强,史玉荣,杨毅,郝希山. 中华胃肠外科杂志. 2006(06)
本文编号：2940095
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：134 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
Akkermansia muciniphila及其衍生物对宿主代谢的影响[40]
通过MTT法检测重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞生长的影响。本实验中,选择不表达Muc2的人正常黑色素细胞HEM作为对照。将铺板的细胞用不同浓度的重组蛋白Amuc-1434处理24 h,再加入MTT孵育4 h,其检测原理为外源性MTT在活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的作用下还原成蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中,DMSO可以将细胞的沉积物完全溶解,通过酶标仪测OD492 nm即可间接反映活细胞数量。细胞存活率为经重组蛋白Amuc-1434处理的实验组和未经重组蛋白Amuc-1434处理的对照组各自减去空白组后的比值。结果如图4.1(A)所示,重组蛋白Amuc-1434随着浓度的增高,抑制LS174T细胞生长的能力越强。当2μg/mL重组蛋白Amuc-1434处理LS174T细胞后,细胞存活率基本不受影响。当8μg/mL重组蛋白Amuc-1434处理LS174T细胞后,细胞存活率为82%。当64μg/mL重组蛋白Amuc-1434处理LS174T细胞后,细胞存活率为70%。由此可见,重组蛋白Amuc-1434能够抑制LS174T细胞的增殖。在图4.1(B)中,当不同浓度的重组蛋白Amuc-1434处理HEM细胞时,发现HEM细胞的存活率都保证在95%以上,并不受重组蛋白Amuc-1434浓度的影响,由此说明重组蛋白Amuc-1434对人正常黑色素细胞HEM无细胞毒性作用。此外,由于HEM细胞不表达Muc2,因此,重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞增殖的抑制作用可能与其降解Muc2的能力有关。4.4.2 重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞周期的影响
由于在MTT检测实验中8μg/mL重组蛋白Amuc-1434开始对LS174T细胞的增殖有抑制作用,而64μg/mL重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞的增殖有最好的抑制效果,因此在接下来的所有实验中,设置重组蛋白Amuc-1434低浓度组和高浓度组的浓度分别为8μg/mL和64μg/mL,同时设置的对照组不经过重组蛋白Amuc-1434处理。机体对细胞周期的调控作用影响细胞增殖的快慢。反过来,细胞增殖一旦受到影响,也往往表现为细胞周期构成的变化。前面的研究已经证实重组蛋白Amuc-1434影响LS174T细胞增殖,因此我们采用流式细胞术检测重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞周期的影响。图4.2(A)显示经ModFit LT 5.0分析的对照组、低浓度组和高浓度组的细胞周期图。在图4.2(B)和(C)中可以看出,对照组G1期占整个细胞周期的52.97%,低浓度组G1期占整个细胞周期的57.37%,高浓度组G1期占整个细胞周期的63.53%。由此可见,和对照组相比,随着重组蛋白Amuc-1434浓度的增高,LS174T细胞周期的G1期占整个细胞周期的比例增大。因此,重组蛋白Amuc-1434可以诱导LS174T细胞发生G1期细胞周期阻滞。除此之外,我们还检测了重组蛋白Amuc-1434对p53(控制细胞周期启动的肿瘤抑制因子)蛋白表达的影响。结果如图4.3所示,和对照组相比,重组蛋白Amuc-1434处理组中p53蛋白表达上调,并且p53蛋白表达量的变化和重组蛋白Amuc-1434浓度呈正相关。图4.3重组蛋白Amuc-1434对细胞周期启动因子p53蛋白表达的影响
【参考文献】：
期刊论文
[1]Colorectal carcinogenesis:Insights into the cell death and signal transduction pathways:A review[J]. Ashok kumar Pandurangan,Thomas Divya,Kalaivani Kumar,Vadivel Dineshbabu,Bakthavatchalam Velavan,Ganapasam Sudhandiran. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2018(09)
[2]p53 mutations in colorectal cancer-molecular pathogenesis and pharmacological reactivation[J]. Xiao-Lan Li,Jianbiao Zhou,Zhi-Rong Chen,Wee-Joo Chng. World Journal of Gastroenterology. 2015(01)
[3]Colorectal carcinogenesis-update and perspectives[J]. Hans Raskov,Hans-Christian Pommergaard,Jakob Burcharth,Jacob Rosenberg. World Journal of Gastroenterology. 2014(48)
[4]Early stage colon cancer[J]. Hugh James Freeman. World Journal of Gastroenterology. 2013(46)
[5]粘蛋白和上皮钙粘附蛋白在结直肠肿瘤组织中的表达及其意义[J]. 于秀文,荣玮,徐凤琳,徐广有,孙玉荣,冯美燕. 癌症. 2007(11)
[6]线粒体途径在肿瘤坏死因子凋亡诱导配体诱导结肠癌细胞凋亡中的调节作用[J]. 郝继辉,俞鸣,李强,史玉荣,杨毅,郝希山. 中华胃肠外科杂志. 2006(06)
本文编号：2940095
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