中扣带回皮层—未定带谷氨酸能神经环路在神经病理性疼痛中的作用研究

发布时间：2021-01-15 01:52

　　慢性疼痛是全球范围内长期致疾的主要原因之一,给社会和家庭带来沉重负担。其中神经病理性疼痛是最常见的一种慢性疼痛,在人群中的发病率高达7%-10%。目前,神经病理性疼痛治疗指南推荐的药物只能对部分患者有效,而且患者常因药物难以耐受的副作用而停药。因此,神经病理性疼痛的治疗仍然是临床的难点,究其原因主要是发病机制尚不清楚。我们亟需解析神经病理性疼痛的发病机制,寻找有效的干预手段和药物作用靶点。神经损伤后大脑多个区域的结构和功能发生改变,但在神经病理性疼痛发生中的作用尚待研究。在本研究中,我们利用在体神经元记录、钙信号光纤记录、光遗传学、化学遗传学、逆向跨单突触追踪和经典药理学等多种方法,研究中扣带皮层Cg2（midcingulate cortex area 2,MCC Cg2）的谷氨酸能神经元(MCC Cg2^Glu)在神经病理性疼痛中的作用及环路机制。我们首先明确MCC Cg2^Glu是否与疼痛有关。通过在体神经元记录结合光纤钙信号记录技术,我们发现疼痛刺激可抑制大多数的MCC Cg2^Glu的神经元活性,表明MCC Cg2

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：129 页

【学位级别】：博士

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麻醉状态下,伤害性刺激抑制中扣带皮层Cg2谷氨酸能神经元活动

神经元的放电不稳定,清醒状态下给予伤害性机械刺激会引起小鼠的躲避反应,影响并干扰神经元的放电。因此在体电生理记录需要在麻醉条件下记录每个神经元的反应。考虑到麻醉状态下可能会影响神经元对外界刺激的反应,我们采用钙信号记录观察清醒状态下神经元的钙信号活动变化。为了进一步观察整个MCC Cg2Glu对伤害性刺激的反应,我们观察了自由活动小鼠在疼痛发生时MCC Cg2一群谷氨酸能神经元的钙信号变化。通过立体定位手术将p AOV-Ca MKIIα-GCAMP6s-e YFP病毒注入到MCC Cg2中(Fig.2A)。免疫组化实验发现,GCa MP6s-e YFP与谷氨酸能神经元标记物Ca MKIIα共定位,证明病毒特异性表达在谷氨酸能神经元上(Fig.2B)。我们用钙信号光纤记录系统实时监测清醒状态下MCC Cg2Glu的神经元群体的活动,发现伤害性pinch刺激立即引起小鼠的撤足反应,但未检测到明显的神经元钙信号变化。考虑到伤害性pinch刺激立即引起防御反应导致刺激太短暂,不利于观察神经元群体钙信号的变化,我们进一步在福尔马林引起的持续性疼痛状态下观察MCC Cg2Glu的钙信号变化。我们发现20μL 2%福尔马林溶液注射于小鼠右侧后爪背部后,左侧MCC Cg2谷氨酸能神经元的钙信号显著降低,而注射生理盐水后没有观察到钙信号的变化。福尔马林引起钙信号的下降是持久的,并且在1 h观察结束时钙信号没有恢复到基线水平(Fig.2C and D)。我们还采用在体单细胞记录方法,记录在福尔马林溶液引起持续性疼痛时MCC Cg2Glu的神经元活动变化。与钙信号光纤记录的结果一致,注射福尔马林溶液后,这些神经元的平均放电频率持续下降(Fig.2E)。以上结果进一步表明在持续性疼痛过程中,MCC Cg2Glu的神经元活性降低。3.2 选择性激活中扣带皮层Cg2 谷氨酸能神经元抑制机械性伤害感受

行为学结果发现,与不给光对照组相比,蓝光特异性激活MCC Cg2Glu显著抬高了机械性PWT(Fig.3D)和机械性PWL(Fig.3E),表明激活MCC Cg2Glu可抑制双侧后爪的机械性伤害感受。统计分析发现蓝光刺激和测试左右侧后爪之间没有相互作用。我们采用热板和Hargreaves实验进一步研究激活MCC Cg2Glu对热伤害感受的影响。有趣的是,我们发现激活MCC Cg2Glu不改变热板(Fig.3F)和Hargreaves测试的PWL(Fig.3F and G)。我们也观察了用不同频率的蓝光激活MCC Cg2Glu对伤害性感受的作用。结果发现,蓝光激活MCC Cg2Glu能够频率依赖地抑制机械性伤害感受,而不同频率蓝光均不影响热伤害感受(Fig.4A-C)。虽然20 Hz与10 Hz蓝光激活MCC Cg2Glu都能抬高双侧后爪的机械性PWT和PWL,但20Hz会在少数动物中诱发癫痫发作。所以我们在此后的实验中采用10 Hz作为蓝光刺激频率。此外,蓝光激活MCC Cg2Glu还能显著减少对侧后爪在福尔马林实验第二相中疼痛反应的持续时间,表明具有抑制炎性疼痛的作用(Fig.3H)。以上结果表明,激活MCC Cg2Glu负性调控疼痛感受,且具有伤害刺激模式依赖性。图4 蓝光激活中扣带皮层Cg2谷氨酸能神经元频率依赖性地抑制机械性伤害感受


本文编号：2977982