SPARC在颅内动脉瘤表达的研究和FAP-1对胶质母细胞瘤活性侵袭迁移的影响

发布时间：2017-04-10 23:42

  本文关键词：SPARC在颅内动脉瘤表达的研究和FAP-1对胶质母细胞瘤活性侵袭迁移的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：论文Ⅰ SPARC在人颅内动脉瘤中的表达及其与mmp-2/-9的关系研究研究背景：颅内动脉瘤(IA)是颅内动脉管壁上的瘤样突起,也是自发性蛛网膜下腔出血的首要原因,而动脉瘤破裂有很高的致死率和致残率。SPARC (Secreted Proti en, Acidic and Rich in Cysteine),即富含半胱氨酸(Cys)的抗粘附酸性糖蛋白,又称作骨连接素或BM-40。它能在多种组织细胞包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞细胞(vascular smooth nuscles cells, VSMCs)以及成纤维细胞中表达,并在组织重构、细胞增殖、以及机体的病理生理过程中有重要作用,日益受到人们的重视。颅内动脉瘤的发生发展需要原有血管扩张、通透性增加、细胞外基质的降解、内皮细胞增生、迁移等病理变化,而细胞外基质的降解是颅内动脉瘤发生发展的关键一步。基质金属酶(MMPs)是参与细胞外基质降解最重要的蛋白酶,它能降解已知的所有基质成分,而MMP-2/-9是最为重要的基质金属蛋白酶,与动脉瘤关系密切。对于血流应力的损伤,颅内动脉血管存在着一个损伤／修复的动态平衡过程,而SPARC能够影响这个平衡,颅内动脉瘤的形成主要是因为这个动态的平衡被打破,因此SPARC对颅内动脉瘤的发生可能起重要作用。探讨SPARC、MMP-2/-9蛋白的表达与动脉瘤发生的相关性对研究动脉瘤形成机制有重要的临床意义。本论文首先总结颅内动脉瘤患者的临床表现及病理学特点,继而通过免疫组织化学技术,检测颅内动脉瘤患者术后标本中SPARC、MMP-2和 MMP-9的表达及分布特点并结合SPARC及MMP-2和MMP-9蛋白的功能,探讨SPARC在颅内动脉瘤发病过程中的作用,期望其成为评估颅内动脉瘤形成和破裂有意义的生物学标志物。研究目的：探讨SPARC、MMP-2/-9在颅内动脉瘤患者组织中的表达及意义,明确SPRAC在动脉瘤中的作用。研究方法：三十一颅内动脉瘤为SPARC,MMP-2和MMP-9行HE和免疫组织化学染色。作为对照,willis动脉管壁同样行免疫组化染色。所有标本包埋在石蜡中。为评价SPARC,MMP-2和MMP-9的表达水平,还用western-blot分析三个可用的新鲜颅内动脉瘤的标本,新鲜的颅内动脉瘤组织的有限是因为大多数患者选择血管内栓塞治疗。结果：1组织学和酶组织化学染色结果HE染色结果显示,光镜下,动脉瘤(全层)几乎看不到平滑肌,弹力纤维缺如,代之以胶原纤维；有时见壁层组织坏死和炎细胞浸润,腔内可见血栓；动脉瘤有时有少量出血；常有附壁血栓,内膜纤维性增厚(胶原纤维)；中膜萎缩,弹力纤维断裂／纤维化／钙化,外膜纤维性增生；慢性炎症反应。2免疫组织化学染色表明动脉瘤组织高表达SPARC,mmp-2和mmp-9结果发现,正常颅内willis动脉管壁的SPARC,mmp-2和mmp-9表现为低阳性或不染色；但人颅内动脉瘤组织的SPARC,mmp-2和mmp-9均表现为强染色。同时观察到,不论未破裂动脉瘤还是破裂动脉瘤SPARC,mmp-2和mmp-9均表现为中至高强度的染色。统计分析表明,SPARC染色和mmp-2和mmp-9的染色的等级相关有统计学意义(p0.001)3 Western-blot分析显示动脉瘤组织比正常颅内动脉管壁高表达SPARC, mmp-2和mmp-9Western-blot结果发现,与正常willis动脉环的动脉相比,颅内动脉瘤组织中的SPARC、mmp-2和mmp-9显著上调结论：SPAR、MMP-2/-9蛋白的表达与颅内动脉瘤发生密切相关,且SPARC蛋白可能通过调控细胞外基质蛋白的表达影响动脉瘤的形成与进展；细胞外基质的破裂很可能是动脉瘤形成的病理生理过程。意义：通过本课题的研究,明确SPARC在颅内动脉瘤中的表达及相关性,并明确其能够调控MMP-2/-9的表达,提供一个新的与颅内动脉瘤密切相关的潜在靶点。论文Ⅱ基于ONCOMINE数据库分析FAP-1的表达与胶质母细胞瘤相关性及在其细胞活性、侵袭、迁移中的实验研究研究背景：胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme, GBM)是恶性程度极高的原发性脑肿瘤,几乎所有的病人死于其高侵入性和对周围脑组织的破坏。尽管对于治疗GBM的众多治疗方案的临床试验取得了许多进展,但过去十年期间GBM的中位生存期一直在15个月左右。虽然对GBM进展的关键分子机制的研究呈爆炸性增长,但仍然未能推动临床的进展。迄今为止,大多数研究涉及神经胶质瘤生物学分子途径重点都放在生长因子受体酪氨酸蛋白激酶(PTK)和磷脂酰肌醇磷酸酶信号通路。和酪氨酸激酶一道,蛋白酪氨酸磷酸酶调控很多重要信号分子的磷酸化状态,尽管相比于酪氨酸激酶来说对其的研究和理解还太少。作为PTP家族中的另外一种重要蛋白是FAP-1 (PTPN13/PTPL1)又称FAS相关磷酸化酶(FAS-associated phosphatase 1)与肿瘤的发生发展也是密切相关。另外,有证据表明,FAP-1可能是一种肿瘤抑制基因。例如,已在胃癌和肝癌观察到,通过启动子甲基化或等位基因丢失能够减少的PTPN13 mRNA表达27-28,并FAP-l敲低提高PLC5细胞增殖28。在一个在结直肠癌的大型突变PTP分析中显示,发现19个PTPNl3突变,其中7个在PTP域,这可能会损害FAP-1的催化活性29。同时,FAP-1是其中的最大细胞内的PTPs,这表明它具有多种功能并可能存在一个背景依赖性的起到积极或消极的作用方式29。因此,FAP-1对耐药性癌症方面是一种很有前途的治疗靶点。本实验的主要目的是明确FAP-1在GBM进展和放化疗抵抗中的作用。研究目的：1 分析oncomine数据库,了解FAP-1与GBM的相关性。2 观察FAP-1在GBM细胞活性、侵袭和迁移方面中的作用及发生的相关分子机制。3 检测FAP-1在GBM细胞对放化疗抵抗方面起的作用。研究方法：1 UCSC基因组数据库检测FAP-1 mRNA的表达我们通过oncomine分析16个磷酸酶在胶质瘤和正常脑组织中的表达情况,这是通过将每个数据集到的阈值标准以包括在分析来实现的。最初用于这项研究的阈值标准是p值0.05mRNA表达的倍数变化1.4。倍数变化被分类在癌组织中和正常组织中的mRNA表达水平的变化进而检测目的基因。基于阈值标准,Oncomine在所有数据集内的所有基因就会得到一个基因排名。获得的图片数据是目的基因基于相对于相同的数据集内的所有其他基因的p值的p值上的兴趣基因的百分比排名。从oncomine上获得的基因表达的数据是基于数转换和标准差标准化到每个阵列研究来实现的。2 FAP-1对GBM细胞活性的影响制备不同浓度(0、6.25nm、12.5nm、25nm)细胞悬液,96孔板内接种细胞/约1000个每孔,放置37℃、C02内培养,第2天更换培养液,放回培养箱培育7天,微量移液器加40ul CV缓冲液/每孔到96孔板内,室温下10分钟,微量移液器取30ul/每孔到相同位置的Celltiter-Glo96孔板内,GloMax 96微孔板发光检测仪检测。3 FAP-1对GBM细胞迁移的影响细胞划痕实验初步检测FAP-1阻断后对细胞迁移的影响；应用细胞微电子芯片检测技术(xCELLLigence)更加准确的检测FAP-1阻断后对细胞迁移的影响。4 FAP-1对GBM细胞mmp-2活性的影响应用western-blot法分析FAP-1转染后蛋白的表达；应用明胶酶谱法检测细胞培养上清液中mmp-2的活性改变。5 FAP-1在GBM细胞对放化疗抵抗中的作用用(Onm、6.25nm、12.5nm、25nm)不同浓度的siRNA转染细胞,后用(0Gy、1.25 Gy、2.5 Gy)不同剂量的射线和不同剂量(0um、125 um、250 um、500um、1000 um)的替莫唑胺处理细胞,细胞活性实验检测细胞活性,记录并统计分析数据。6 FAP-1对其他信号通路分子(AKT、ERKl/2)的影响接种细胞到6孔板并EGF处理细胞,western-blot检测p-AKT、t-AKT、 p-ERK1/2、t-ERK1/2的表达。研究结果：1 oncomine数据库分析显示FAP-1与GBM密切相关通过分析数据库,在九项研究中有六项结果发现,与正常脑组织相比,GBM中PTPN13/FAP-1的mRNA的表达明显增强,另外三项研究发现PTPN13/FAP-1的mRNA的表达无明显差异。此数据表明,PTPN13/FAP-1的表达可能与肿瘤发生和发展相关。2 敲除FAP-1能够增强GBM细胞活性随着转染浓度的升高,结果发现LN18和U87MG两组细胞的活性均逐渐增强,不过,通过多组ANOVA分析发现只有浓度6.25nm有统计学意义(p0.001)。上述结果提示,FAP-1能够介导细胞的活性,同时其功能的体现有浓度依赖性。3 敲除FAP-1能够增强GBM细胞迁移细胞划痕实验结果发现,随着转染的浓度增强,U87MG组细胞迁移明显增强,但是LN18组只有25nm处其细胞迁移增强,其余浓度的细胞迁移反而下降,这可能与实验变异有关。细胞微电子芯片检测技术(xCELLLigence)实验结果证实LN18组中,与对照组相比,转染组中迁移率增强33%(P＜0.001); U87MG组中,与对照组相比,转染组中迁移率同样增强42%(P0.001)。4 FAP-1能够增强GBM细胞mmp-2的活性明胶酶谱实验结果显示,随着转染的浓度的增加,LN18组和U87MG组的mmp-2活性逐渐增强,但两组中不同转染浓度的mmp-2活性升高程度不一。5 FAP-1表达减少能够增加GBM细胞放射抵抗和替莫唑胺耐药细胞活性检测结果显示,在LN18组中,放射组、替莫唑胺组和转染组有统计学意义(P=0.002),放射组和替莫唑胺组没有表现出明显的统计学意义；在U87MG组中,替莫唑胺组和转染组和放射组均有明显统计学意义(P0.001),放射组和转染组、替莫唑胺组和转染组均有明显相关作用(p0.001) western-blot结果发现,LN18和U87MG组细胞均出现随着替莫唑胺浓度的增加,FAP-1的表达逐渐降低,同时,FAP-1在第3天的表达明显低于于第1天的表达,提示FAP-1能够被替莫唑胺诱导失活。6 Western-blot分析FAP-1沉默后AKT和ERK1/2磷酸化状态结果发现,两组细胞中,p-AKT、p-ERK1/2的表达均下降,而EGF处理细胞后,p-AKT、p-ERK1/2的表达又增强到对照组状态。上述结果一定程度上说明,FAP-1能够通过影响AKT和ERK1/2的磷酸化状态来调控细胞的生物学活性,同时说明,可能有另外的信号蛋白参与FAP-1的功能的实现,但具体机制需要进一步研究证实。结论：1 FAP-1的mRNA在胶质母细胞瘤中高表达并与其发生进展密切相关。2阻断FAP-1能够增强胶质母细胞瘤细胞系细胞的活性、增强细胞迁移、增强细胞侵袭。3 实验证实阻断FAP-1能够增强GBM细胞对治疗抵抗作用,提示FAP-1失活可能是GBM疗效欠佳和预后不良的重要因素之一。意义：本实验是国际上首次基于oncomine数据库大规模分析16个重要蛋白酪氨酸磷酸酶(FAP-1等)与胶质母细胞瘤的相关性,并为未来更多的人参与到大数据分析目的基因和肿瘤之间关系提供重要依据；同时初步证实FAP-1可能是一个与胶质母细胞瘤恶性程度密切相关的生物学标记蛋白。
【关键词】：SPARC 颅内动脉瘤 细胞外基质 免疫组织化学 胶质母细胞瘤 FAP-1 侵袭和迁移 蛋白酪氨酸磷酸酶
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743;R739.4
【目录】：

• 中文摘要6-13
• 英文摘要13-22
• 英文缩略语中英文对照22-25
• 论文Ⅰ SPARC在人颅内动脉瘤中的表达及其与mmp-2/-9的关系研究25-51
• 前言25-27
• 材料和方法27-32
• 结果32-34
• 讨论34-37
• 结论37-38
• 附表和附图38-47
• 参考文献47-51
• 论文Ⅱ 基于ONCOMINE数据库分析FAP-1的表达与胶质母细胞瘤相关性及在其细胞活性、侵袭、迁移中的实验研究51-169
• 前言51-54
• 材料和方法54-63
• 实验结果63-69
• 讨论69-73
• 结论73-74
• 附图74-164
• 参考文献164-169
• 综述169-184
• 参考文献176-184
• 致谢184-185
• 攻读学位期间发表的学位论文185-186
• 学位论文评阅及答辩情况表186-187
• 英文全文Ⅰ187-215
• 英文全文Ⅱ215-237

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本文编号：297821