脂肪间质干细胞结合β磷酸三钙局部移植及系统应用活性维生素D修复骨缺损的作用研究

发布时间：2017-04-14 09:10

  本文关键词：脂肪间质干细胞结合β磷酸三钙局部移植及系统应用活性维生素D修复骨缺损的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景：肿瘤、损伤及先天畸形导致的骨组织缺损一直是临床医生面临的难题。多年来,学术界不断探索针对骨组织缺损的修复方式,其中骨组织工程可谓是最有前景的治疗手段之一。传统的组织工程在修复骨缺损时,通常采用骨髓基质干细胞作为工程细胞与支架材料结合移植到骨缺损中。骨髓基质干细胞在成骨分化、分泌骨基质及诱导矿化方面的能力毋庸置疑,但是将骨髓基质干细胞广泛应用于临床治疗尚存在一些不利因素,例如骨髓基质干细胞在体内的储量非常有限,提取过程复杂且创伤大。因此,近年来,学者们开始尝试探索其他来源的同样具有多能分化潜质的细胞来代替骨髓基质干细胞。这些细胞包括：脂肪间质干细胞(ADSC)、成肌细胞、软骨细胞、成纤维细胞、脐带血干细胞、皮肤前体细胞、间皮细胞以及卵巢滤泡颗粒细胞等。他们具有干细胞性质并可分化为三个胚层中任何一种细胞系。在这些细胞中,ADSC或许是最适合骨组织工程的细胞,因为它在体内脂肪组织中存量相当丰富,易于提取,收集过程创伤较小,且在体外生长迅速,对培养条件要求不高,经过简单的成骨分化诱导就可以快速地表达成骨细胞特异性蛋白。ADSC程梭形,与支架材料亲和性高,经成骨分化诱导后,可表达成骨细胞相关特异性标记物如：碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)、及runt相关转录因子2 (Runx2)等。除干细胞外,支架材料也是组织工程的重要组成要素,而骨组织工程应用最广泛的支架材料当属磷酸三钙(TCP)。磷酸三钙可分为两个亚型即α-TCP和β-TCP。早期骨组织工程多选用α-TCP作为支架材料,然而与α-TCP相比,近来备受关注的β-TCP具有更好的组织相容性,以及更接近于新骨形成速率的降解率,并且降解后无任何残留。β-TCP与ADSC共培养时,ADSC可在24小时内覆盖β-TCP表面95%的面积。另外,β-TCP还具有一定的诱导成骨细胞分化的作用。组织工程最后一个重要构成就是细胞因子,常用的细胞因子有骨形成蛋白2和7(BMP-2,BMP-7)等,BMP是一族生长因子家族,可调控骨及软骨的形成,但BMP复合支架材料价格相对昂贵,难以在临床广泛应用。多年来,1,25 (OH)2D3即维生素D体内活性形式骨化三醇(calcitrol)及其类似物由于可以增加骨矿化密度(BMD)及相对低廉的价格,一直被用于治疗骨质疏松症,而近年来研究发现,成骨细胞、骨细胞以及破骨细胞均有维生素D受体(VDR)的表达。我们推测,calcitrol及其类似物可以直接作用于上述骨组织细胞,调节其功能活性。因此,我们希望通过将ADSC, β-TCP以及calcitrol或其类似物结合起来,探索一种用于修复骨组织缺损的新型组织工程治疗方案,并揭示其作用机制。实验目的：本实验的目的在于通过一系列体内及体外实验,来评价ADSC, β-TCP以及calcitrol结合修复骨缺损的效果,并深入探究活性维生素D及其类似物影响成骨细胞及破骨细胞功能活性的机制,最后,对比calcitrol及其类似物之一艾地骨化醇(eldecalcitol)在治疗骨缺损效果上的差异,希望得到一种最佳的治疗方案组合。实验方法：在第一阶段研究中,我们提取大鼠皮下脂肪组织,分离获得ADSC并于体外进行培养。当细胞生长至80%接触后,将ADSC与预制备的β-TCP灭菌颗粒共同培养并将培养基更换为成骨分化诱导培养基。共培养21天后,制备大鼠股骨缺损模型,并使用附有ADSC的β-TCP颗粒进行修复。术后经腹腔注射给予calcitrol (125ng/Kg,1次/2天),于治疗第7天、14天及28天取股骨标本,进行组织形态学分析,评价骨修复效果。在实验第二阶段,我们对体外培养的成骨细胞系MC3T3-E1细胞进行成骨分化诱导,并向培养基中分别加入calcitrol (10-8M)及 eldecalcitol (10-8M),刺激7天及14天后提取总蛋白,通过western blot检测调控成骨细胞功能的Runx2,以及调控破骨细胞分化的核因子kB配体受体激活剂(RANKL)及骨保护素(OPG)等蛋白,以期揭示活性维生素D及其类似物调控骨形成及骨吸收的机制。在第三阶段实验中,我们同样制备大鼠股骨缺损模型,在不进行支架材料植入的情况下,经口投给calcitrol (50ng/kg,1次/2天)及eldecalcitol (50ng/kg,1次/2天)治疗,分别于28天及56天时,通过组织形态学手段,对比calcitrol及eldecalcitol在骨缺损修复中的效果。实验结果：第一阶段实验发现,ADSC, β-TCP及calcitrol联合用于骨缺损修复时,可以明显增加新骨形成的量,同时,由于ADSC的存在,在新骨形成区域,检测到高水平表达的ALP和Runx2。Calcitrol在骨缺损修复早期,表现出对破骨细胞强烈的抑制作用,在减少破骨细胞数量的同时,也抑制了组织蛋白酶K(CK)的表达。第二阶段实验证实,在体外培养体系中加入calcitrol及eldecalcitol均可促进MC3T3-E1细胞Runx2及OPG的表达,并抑制RANKL的表达。而calcitrol对MC3T3-E1的这种调控作用略强于eldecalcitolo第三阶段实验发现,在分别应用calcitrol (CAL组)和eldecalcitol (ELD组)治疗骨缺损28天后,CAL组新骨形成量略高于ELD组,且两实验组均明显高于对照组。治疗56天后,CAL组和ELD组在新骨骨量上已没有明显差异,但ELD组新骨基质中未矿化胶原面积略大于CAL组。CK染色显示,28天时,calcitrol即表现出对CK阳性破骨细胞较强的抑制作用,而在ELD组,这种对破骨细胞的抑制作用在56天时才开始显现。结论：1. ADSC经成骨分化诱导,并以β-TCP为载体植入骨缺损后,可以大量表达ALP,并在缺损修复早期表达高水平的Runx2。2.活性维生素D体内投给可明显减少破骨细胞的数量,并且抑制CK的表达。3.Calcitrol及eldecalcitol可直接作用于成骨细胞,促进Runx2及OPG的表达,促进成骨,并可抑制成骨细胞表达RANKL,从而间接抑制破骨细胞分化。4.与eldecalcitol相比,calcitrol可以更快的促进骨缺损区新骨的形成及矿化,且对破骨细胞功能的抑制作用较eldecalcitol出现的早。因此,我们认为,将ADSC,β-TCP与calcitrol结合,应用于骨缺损修复将是一个有效可行的组织工程治疗方案。
【关键词】：脂肪间质干细胞 β磷酸三钙 活性维生素D 骨缺损修复
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 符号说明14-15
• 第一部分15-43
• 1. 简介15-18
• 2. 材料和方法18-27
• 2.1 实验动物18
• 2.2 实验仪器18-19
• 2.3 实验药品19-20
• 2.4 实验试剂配制20-23
• 2.5 实验方法23-27
• 2.5.1 脂肪间质干细胞的分离23-24
• 2.5.2 脂肪间质干细胞体外成骨分化诱导并与β磷酸三钙共培养24
• 2.5.3 应用β-TCP-ADSC修复股骨缺损及活性维生素D投给24-26
• 2.5.4 免疫组织化学检测ALP、Runx2和CK的表达以及TRAP染色26
• 2.5.5 统计学分析26-27
• 3. 结果27-35
• 3.1 ADSC成骨分化诱导27
• 3.2 新骨形成量评估27-29
• 3.3 ALP及Runx2免疫组化染色29-32
• 3.4 TRAP染色及CK免疫组化检测32-35
• 4. 讨论35-36
• 5. 结论36-38
• 参考文献38-43
• 第二部分43-65
• 1. 简介43-44
• 2. 材料和方法44-53
• 2.1 实验细胞44
• 2.2 实验仪器44-45
• 2.3 实验药品45-46
• 2.4 实验试剂配制46-51
• 2.5 实验方法51-53
• 2.5.1 MC3T3-E1细胞体外培养及成骨分化诱导51
• 2.5.2 Western blot检测Runx2,OPG以及RANKL的表达51-53
• 2.5.3 统计学分析53
• 3. 结果53-56
• 4. 讨论56-58
• 5. 结论58-60
• 参考文献60-65
• 第三部分65-82
• 1. 简介65-66
• 2. 材料和方法66-72
• 2.1 实验动物66
• 2.2 实验仪器66-67
• 2.3 实验药品67-68
• 2.4 实验试剂配制68-71
• 2.5 实验方法71-72
• 2.5.1 大鼠股骨缺损的制备71-72
• 2.5.2 骨基质胶原矿化程度评价72
• 2.5.3 破骨细胞定位及功能评价72
• 2.5.4 统计学分析72
• 3. 结果72-77
• 3.1 新骨骨量及矿化度评估72-76
• 3.2 破骨细胞功能状态评价76-77
• 4. 讨论77-79
• 5. 结论79-80
• 参考文献80-82
• 全文结论82-83
• 致谢83-84
• 博士期间发表学术论文84-85
• 附录85-138
• 附件138

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本文编号：305673