miR-10b在人肝细胞肝癌发生中的作用及其机制的初步探索

发布时间：2017-04-14 21:06

  本文关键词：miR-10b在人肝细胞肝癌发生中的作用及其机制的初步探索，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【研究背景】肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一个多因素、多途径的复杂病变过程,具有发病隐匿、进展快、死亡率高的特点。因此,尽快从分子水平阐明HCC的发病机制对预防、诊断和治疗至关重要。探索染色体畸变和相关基因异常已成为肿瘤研究的重要切入点。其中,癌基因的过表达和抑癌基因的缺失或低表达是HCC发生、进展的关键环节,促进了肿瘤的恶性增殖和转移等生物学性状。因此,积极寻找新的诊断标记物、发现有效的作用靶点、探索HCC的侵袭转移机制,越来越多的受到人们的关注。微小RNA(micro RNA)(以下简称mi RNA)是一类由17-25个核苷酸组成的非编码单链小RNA分子,参与转录后水平调控。成熟的mi RNA与RNA沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)形成RISC-mi RNA复合物。复合物与靶基因信使RNA(messenger RNA,m RNA)的3’-非翻译区(untranslated region,UTR)不完全配对结合调控靶基因的表达。mi RNA具有组织、时序特异性,不同的肿瘤呈现出特异的mi RNA表达谱,这为肿瘤的诊断、治疗和预后评估提供了新的可行的标记物和治疗干预靶点。目前,关于HCC相关mi RNA表达谱的研究越来越多,并且报道了一些与HCC鉴别诊断、预后评估、侵袭转移等相关的mi RNA,以此为临床应用提供新的、具有可行性和可操作性的科学依据。通过对文献中的mi RNA表达谱筛选和查阅相关文献,我们发现mi R-10b在多种肿瘤组织中呈高表达,但在HCC中的表达变化及功能研究相对匮乏。mi R-10b定位于2号染色体的HOX基因簇,推测其与肿瘤的侵袭转移密切相关。通过相关生物信息学方法及软件进行搜索、比对,我们发现CSMD1(CUB and Sushi multiple domains 1)可能是mi R-10b的靶基因。CSMD1是一个单次跨膜蛋白,位于氨基端的胞外区包含CUB和Sushi结构域,其功能可能与蛋白质-蛋白质和蛋白质-配体的相互作用有关,并且该区域有信号肽的存在;位于羧基端的胞浆区由63个氨基酸残基组成,有三个磷酸化位点。这表明CSMD1可能是膜受体或粘附因子,参与信号转导通路,从而参与HCC的发生、进展。近年来的研究显示,CSMD1是一个新候选的肿瘤抑制基因,但其在HCC中的研究极少。因此,我们首次在HCC中进行了mi R-10b和CSMD1的相互关系及功能机制的研究,以阐明它们在HCC过程中的作用,从而为HCC的诊断和治疗提供新的候选基因和作用靶点。【目的】检测mi R-10b在HCC组织中的表达,并阐明mi R-10b与CSMD1在HCC中的相互关系及功能机制,为HCC的诊断和治疗提供新的候选基因和作用靶点。【方法】1.利用实时荧光定量多聚酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测mi R-10b在HCC组织中的表达水平;2.利用q RT-PCR检测mi R-10b在正常肝细胞和肝癌细胞系中的表达水平,筛选出mi R-10b表达与HCC组织相一致的细胞系;采用脂质体2000转染mi R-10b mimic、inhibitor及各自相应的阴性对照,分别进行MTT实验、Transwell实验、划痕实验、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验,并用流式细胞仪测定其对细胞周期和凋亡的影响,观察mi R-10b对细胞生物学性状的影响;3.采用裸鼠皮下成瘤实验,在瘤内多点注射agomir-10b及其阴性对照,观察mi R-10b在体内环境对肿瘤生长性状的影响;4.采用双荧光素酶报告实验验证mi R-10b和CSMD1之间是否存在直接负转录调控作用,并明确其结合位点;利用q RT-PCR和免疫组化验证CSMD1和mi R-10b在m RNA水平和蛋白水平是否存在负向表达调控关系;5.采用脂质体2000转染CSMD1的si RNA及其阴性对照,利用q RT-PCR和细胞免疫组化检验转染效率后,进行MTT实验、Transwell实验,观察CSMD1对细胞生物学性状的影响;在免疫组化水平检测临床HCC病例中CSMD1的表达情况,分析CSMD1在HCC中的作用。【结果】1.与非肿瘤肝组织相比,mi R-10b在HCC组织中的表达水平显著上调(-1.4590±0.69542 vs.-1.7312±0.62758,p0.01),且mi R-10b的表达水平与患者年龄、HBV感染有相关性;2.MTT、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验结果显示mi R-10b促进细胞增殖;划痕实验和Transwell实验结果显示mi R-10b促进细胞迁移和侵袭;流式细胞仪检测结果显示mi R-10b促进细胞增殖、抑制细胞凋亡;3.裸鼠皮下成瘤实验结果显示,与对照组相比,agomir-10b组肿瘤生长更快,体积更大;4.双荧光素酶报告实验结果显示mi R-10b对CSMD1 3’UTR有直接负转录调控作用,结合位点为707-713位点;q RT-PCR和免疫组化结果显示mi R-10b与CSMD1之间呈负表达调控关系;5.CSMD1的si RNA沉默效率达到70%左右,MTT实验结果显示CSMD1低表达促进细胞增殖;Transwell实验结果显示CSMD1低表达促进细胞迁移和侵袭;与非肿瘤肝组织相比,临床HCC中CSMD1呈低表达。【结论】1.与非肿瘤肝组织相比,mi R-10b在HCC中的表达显著上调,且mi R-10b上调的水平与患者年龄及HBV感染呈正相关,提示mi R-10b可能与HCC发生有相关;2.mi R-10b促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭,并抑制肝癌细胞凋亡,且mi R-10b在体内环境又促进肿瘤生长,提示mi R-10b在HCC发生中可能具有癌基因的功能;3.mi R-10b与HCC发生相关作用机制可能与mi R-10b负向调控CSMD1基因表达有关,CSMD1在HCC中具有抑癌基因的功能;综上所述,本研究首次发现mi R-10b与HCC发生相关,其作用机制可能与mi R-10b负向调控CSMD1基因表达有关。研究结果为HCC病因及分子遗传学研究提供了新的思路,也为HCC的个体化诊断提供了新的潜在分子标志物。
【关键词】：肝细胞肝癌 microRNA miR-10b CSMD1
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 缩略语表7-10
• 中文摘要10-14
• ABSTRACT14-18
• 前言18-20
• 文献回顾20-35
• 1.HCC的发生及相关抑癌基因20-24
• 2.MIRNA的生物学特性及在肿瘤发生发展中的作用24-31
• 3.CSMD1在HCC中的研究进展31-35
• 第一部分 MIR-10B在HCC中的表达以及临床意义35-42
• 1 材料35-36
• 1.1 HCC组织样本35-36
• 1.2 主要试剂36
• 1.3 主要仪器36
• 2 方法36-39
• 2.1 应用qRT-PCR技术检测miR-10b在进展期HCC中的表达36-39
• 3 结果39-41
• 3.1 RNA提取质量鉴定39
• 3.2 q RT-PCR检测miR-10b在HCC中的表达变化39-40
• 3.3 miR-10b在HCC中的表达水平与患者临床病理特征参数的关系40-41
• 4 讨论41-42
• 第二部分 MIR-10B对肝癌细胞生物性状的影响42-57
• 1 材料42-44
• 1.1 细胞系42
• 1.2 主要试剂42-43
• 1.3 主要仪器43-44
• 2 方法44-49
• 2.1 应用qRT-PCR技术检测miR-10b在HL-7702、HepG2、SK-hep-1、Huh7中的表达情况44-45
• 2.2 细胞转染45-46
• 2.3 四甲基偶氮唑盐比色法（3-(4,5-Dimethyl2thiazolyl)-2,5-diphenyl2H-tetrazolium bromide, MTT）实验46
• 2.4 Transwell 实验46-47
• 2.5 划痕实验47
• 2.6 平板克隆形成实验47
• 2.7 软琼脂克隆形成实验47-48
• 2.8 流式细胞术检测细胞周期和凋亡48-49
• 2.9 统计学方法49
• 3 结果49-55
• 3.1 q RT-PCR检测miR-10b在正常肝细胞和肝癌细胞系中的表达变化49
• 3.2 q RT-PCR检测细胞转染效率49-50
• 3.3 miR-10b对HepG2细胞增殖能力的影响50-52
• 3.4 miR-10b对HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响52-53
• 3.5 miR-10b对HepG2细胞周期和凋亡的影响53-55
• 4 讨论55-57
• 第三部分 MIR-10B对裸鼠皮下成瘤的影响57-63
• 1 材料57-58
• 1.1 裸鼠57
• 1.2 细胞系57
• 1.3 主要试剂57-58
• 1.4 主要仪器58
• 2 方法58-60
• 2.1 agomir-10b对裸鼠皮下成瘤的影响58-59
• 2.2 统计学方法59-60
• 3 结果60-62
• 3.1 agomir-10b对裸鼠皮下成瘤的影响60-62
• 4 讨论62-63
• 第四部分 MIR-10B与CSMD1靶向关系的研究63-83
• 1 材料63-65
• 1.1 细胞系63
• 1.2 载体63-64
• 1.3 主要试剂64
• 1.4 主要仪器64-65
• 2 方法65-75
• 2.1 3’UTR载体构建实验65-71
• 2.2 双荧光素酶报告实验71-72
• 2.3 应用qRT-PCR技术检测CSMD1 mRNA水平72-73
• 2.4 细胞免疫组化73-74
• 2.5 组织免疫组织化学染色74
• 2.6 统计学方法74-75
• 3 结果75-82
• 3.1 野生型和突变型载体构建成功75-79
• 3.1.1 PCR扩增目的基因CSMD13’UTR片段及5个菌落PCR鉴定结果75-79
• 3.2 双荧光素酶报告实验结果79
• 3.3 q RT-PCR检测miR-10bmimic和inhibitor转然后CSMD1表达变化79-80
• 3.4 细胞免疫组化检测CSMD1表达变化80-81
• 3.5 组织免疫组化检测CSMD1表达变化81-82
• 4 讨论82-83
• 第五部分 CSMD1在肝癌细胞系和HCC中功能的初步探索83-92
• 1 材料84-85
• 1.1 细胞系84
• 1.2 组织样本84
• 1.3 主要试剂84
• 1.4 主要仪器84-85
• 2 方法85-86
• 2.1 细胞转染85-86
• 2.2 q RT-PCR86
• 2.3 细胞免疫组织化学86
• 2.4 MTT实验86
• 2.5 Transwell实验86
• 2.6 免疫组织化学86
• 2.7 统计学方法86
• 3 结果86-90
• 3.0 siRNA和NC转染后CSMD1mRNA表达变化86-87
• 3.1 siRNA和NC转染后CSMD1蛋白表达变化87
• 3.2 MTT实验对HepG2细胞增殖能力的影响87-88
• 3.3 CSMD1 siRNA对HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响88-89
• 3.4 CSMD1在HCC中免疫组化结果89-90
• 4 讨论90-92
• 小结92-93
• 参考文献93-109
• 附录109-111
• 个人简历和研究成果111-112
• 致谢112

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