基于荧光标记G蛋白偶联受体细胞模型的环境雌激素检测及新药筛选研究
发布时间：2021-03-26 20:20
G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors,GPCRs）是细胞表面最重要的受体之一,它涉及到一系列细胞的代谢和信号传导过程,与许多重大疾病相关,同时也是许多环境激素的靶点,也是药物开发的重要靶点。目前利用GPCRs也开发了一些的检测和药物筛选技术和方法,但它们都存在敏感性不高、自动化程度低等缺点,因此如何利用不同受体的特点开发特异性强、灵敏性高和稳定性好的检测和筛选技术是我们亟待解决的问题。本论文为更好地避免N末端标记可能会对受体配件结合的影响,通过基因工程技术构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP）标记受体C末端的重组细胞系的策略,以期最大限度地降低融合蛋白对受体与配体结合的影响;又利用高内涵筛选（High Content Screening,HCS）技术,建立起可对样品进行可视化和自动化的检测和筛选系统。首先,论文选择将绿色荧光蛋白（tGFP）直接标记在雌激素受体α（Estrogen Receptorα,ERα）受体的C末端的重组细胞系构建策略。首先构建了ERα/pCMV6穿梭质粒,其中含CMV真核启动,而SV4...
【文章来源】：昆明理工大学云南省
【文章页数】：163 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
GPCR的基本结构
掀?⒎纤?⒐烫逦廴炯霸胍簟⒎?湮廴尽Ｒ部梢园次廴镜男?质分为物理污染和化学污染。到目前为止，在各式各样环境污染的因素中，化学污染最为严重，约占总污染的80%到90%，是公认的潜在危害最大的一类污染因素。据统计，在目前已知的2000多万种化学物质中已经确认对人体健康和生态环境具有潜在危害。而目前人们新开发的化学物质仍然以每周约600种的速度在增长，这些化合物最终都将进入到环境中，并通过在不同介质间扩散、迁移、转化或积累，并不断地与环境相互作用，最终对人类和其他各种生态系统的生存和发展带来显著的影响（图1.2）。因此，如何有效地检测、监测、评价和消除导致环境污染的化学物质是环境科学面临的一项重大科学问题。图1.2环境与化学物质的相互作用[57]Fig.1.2Theinteractionoftheenvironmentwithchemicals1.3.2化学污染物及其分类目前全球已合成的各种化学物质已超过2000多万种，而每年新登记注册投放市场的新化合物仍然以约3000种/年的速度在增长。仅以我国为例，已能合成的化学药品已超过3.7万种。这些化学药品在扑灭虫害、提高来的生产力、减少疾并推动社会进步、方便人民群众的生活方面发挥了巨大作用，但同时这些化学药品在生产环节以及随后的运输、使用、废弃过程中都不可避免地会进入到环境而产生可能的环境污染。关于化学污染物的分类因
昆明理工大学博士学位论文20光显微镜可获得样品细胞活性的图像信息,可以定性观察，也可以定量分析，由于不依赖下游事件，短时间内收集图像信息，干扰少，假阳性率较低，而且荧光检测非常敏感，因此不仅能检测纯化合物的活性，也能在提取物中灵敏快速地发现微量活性物质，假阴性率较低，检测结果可作为活性导向分离的依据，能显著提高发现活性化合物的效率（图1.4）。图1.4利用荧光标记GPCRs的检测和筛选平台Fig.1.4ThedetectionandScreeningplatformbasedonGFPlabeledGPCRs总之，受体及其效应复合体的荧光成像高内涵筛选技术的创立使得我们能够从疾病基因相关调控通路和信号传导网络水平上研究药物的作用机制、代谢途径等，使在在细胞水平上可以全面评价化合物的生物效应。能够进行灵敏、准确的高内涵靶向活性检测，能对天然药物的粗提取物进行直接检测，降低假阴性率，提高成功率，克服了先分离再检测活性的传统检测和筛选模式的弊端。该技术可以在复方、天然药物粗提物、有效部位、有效成分等筛选中发挥很大的作用，该技术还具备高通量的能力，非常符合云药产业以中药、天然药物为主的新药研发需求。1.5研究内容与技术路线1.5.1研究内容1）以雌激素受体Ea、人糖尿病胰高血糖素1受体（Glucagon-likepeptide1Receptor，GLP1receptor）和心血管疾病相关嘌呤受体Y1（Purinergicreceptor）三个GPCR家族的受体为材料构建荧光标记细胞模型。2）建立三个细胞模型的高内涵检测和筛选体系，实现自动化、可视化和定性、定量分
【参考文献】：
期刊论文
[1]桑叶粉和发酵桑叶粉对胡须鸡生长性能、血清生化指标及抗氧化指标的影响[J]. 黄静,邝哲师,廖森泰,赵祥杰,潘木水. 动物营养学报. 2016(06)
[2]特异性抗肝癌单味中草药提取物的高通量筛选[J]. 杨秀颖,张莉,杨海光,李莉,方莲花,杜冠华. 中国药理学与毒理学杂志. 2016(03)
[3]基于肺部苦味受体抗哮喘天然活性成分筛选模型的建立与应用[J]. 胡毅翔,蔡伟,张欢欢,余陈欢,俞文英,金晓音,应华忠. 中草药. 2016(05)
[4]抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法的优化及验证[J]. 潘勇兵,张雅婷,张银川,宋桂芝,桂芳,闭兰. 中国生物制品学杂志. 2015(11)
[5]不同添加水平半胱胺对奶牛泌乳性能和血清生化指标的影响[J]. 杨宏波,刘红,余同水,陈志远,朱隆基,陈银岳,赵国琦. 中国农业大学学报. 2015(05)
[6]以中链脂肪酸受体GPR84为靶点的药物高通量筛选模型的建立和应用[J]. 张庆,杨慧,李佳,谢欣,李静. 生物化学与生物物理进展. 2015(04)
[7]胰高血糖素样肽1或其类似物体外生物活性检测方法的建立[J]. 邵妤,赵威,王微,曲国龙,阚乃鹏,凌婧怡,谭俊杰,刘刚,陈惠鹏. 生物技术通讯. 2015(01)
[8]化学污染的分类及防治方法[J]. 如风. 化工管理. 2014(07)
[9]欧美国家畜禽养殖业中雌激素管理法规及措施[J]. 冯成洪,林建德,邵坚,刘姝芳,杨明,李艳霞,张荣华. 环境污染与防治. 2011(12)
[10]不同类别食品中21种邻苯二甲酸酯的气相色谱-质谱测定及其分布情况研究[J]. 吴惠勤,朱志鑫,黄晓兰,林晓珊,黄芳,马叶芬,罗辉泰,邓欣,潘亮君. 分析测试学报. 2011(10)
硕士论文
[1]桑叶对肉羊生产性能、血液生化指标、免疫抗氧化功能和肉品质的影响[D]. 李伟玲.内蒙古农业大学 2012
本文编号：3102190
【文章来源】：昆明理工大学云南省
【文章页数】：163 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
GPCR的基本结构
掀?⒎纤?⒐烫逦廴炯霸胍簟⒎?湮廴尽Ｒ部梢园次廴镜男?质分为物理污染和化学污染。到目前为止，在各式各样环境污染的因素中，化学污染最为严重，约占总污染的80%到90%，是公认的潜在危害最大的一类污染因素。据统计，在目前已知的2000多万种化学物质中已经确认对人体健康和生态环境具有潜在危害。而目前人们新开发的化学物质仍然以每周约600种的速度在增长，这些化合物最终都将进入到环境中，并通过在不同介质间扩散、迁移、转化或积累，并不断地与环境相互作用，最终对人类和其他各种生态系统的生存和发展带来显著的影响（图1.2）。因此，如何有效地检测、监测、评价和消除导致环境污染的化学物质是环境科学面临的一项重大科学问题。图1.2环境与化学物质的相互作用[57]Fig.1.2Theinteractionoftheenvironmentwithchemicals1.3.2化学污染物及其分类目前全球已合成的各种化学物质已超过2000多万种，而每年新登记注册投放市场的新化合物仍然以约3000种/年的速度在增长。仅以我国为例，已能合成的化学药品已超过3.7万种。这些化学药品在扑灭虫害、提高来的生产力、减少疾并推动社会进步、方便人民群众的生活方面发挥了巨大作用，但同时这些化学药品在生产环节以及随后的运输、使用、废弃过程中都不可避免地会进入到环境而产生可能的环境污染。关于化学污染物的分类因
昆明理工大学博士学位论文20光显微镜可获得样品细胞活性的图像信息,可以定性观察，也可以定量分析，由于不依赖下游事件，短时间内收集图像信息，干扰少，假阳性率较低，而且荧光检测非常敏感，因此不仅能检测纯化合物的活性，也能在提取物中灵敏快速地发现微量活性物质，假阴性率较低，检测结果可作为活性导向分离的依据，能显著提高发现活性化合物的效率（图1.4）。图1.4利用荧光标记GPCRs的检测和筛选平台Fig.1.4ThedetectionandScreeningplatformbasedonGFPlabeledGPCRs总之，受体及其效应复合体的荧光成像高内涵筛选技术的创立使得我们能够从疾病基因相关调控通路和信号传导网络水平上研究药物的作用机制、代谢途径等，使在在细胞水平上可以全面评价化合物的生物效应。能够进行灵敏、准确的高内涵靶向活性检测，能对天然药物的粗提取物进行直接检测，降低假阴性率，提高成功率，克服了先分离再检测活性的传统检测和筛选模式的弊端。该技术可以在复方、天然药物粗提物、有效部位、有效成分等筛选中发挥很大的作用，该技术还具备高通量的能力，非常符合云药产业以中药、天然药物为主的新药研发需求。1.5研究内容与技术路线1.5.1研究内容1）以雌激素受体Ea、人糖尿病胰高血糖素1受体（Glucagon-likepeptide1Receptor，GLP1receptor）和心血管疾病相关嘌呤受体Y1（Purinergicreceptor）三个GPCR家族的受体为材料构建荧光标记细胞模型。2）建立三个细胞模型的高内涵检测和筛选体系，实现自动化、可视化和定性、定量分
【参考文献】：
期刊论文
[1]桑叶粉和发酵桑叶粉对胡须鸡生长性能、血清生化指标及抗氧化指标的影响[J]. 黄静,邝哲师,廖森泰,赵祥杰,潘木水. 动物营养学报. 2016(06)
[2]特异性抗肝癌单味中草药提取物的高通量筛选[J]. 杨秀颖,张莉,杨海光,李莉,方莲花,杜冠华. 中国药理学与毒理学杂志. 2016(03)
[3]基于肺部苦味受体抗哮喘天然活性成分筛选模型的建立与应用[J]. 胡毅翔,蔡伟,张欢欢,余陈欢,俞文英,金晓音,应华忠. 中草药. 2016(05)
[4]抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法的优化及验证[J]. 潘勇兵,张雅婷,张银川,宋桂芝,桂芳,闭兰. 中国生物制品学杂志. 2015(11)
[5]不同添加水平半胱胺对奶牛泌乳性能和血清生化指标的影响[J]. 杨宏波,刘红,余同水,陈志远,朱隆基,陈银岳,赵国琦. 中国农业大学学报. 2015(05)
[6]以中链脂肪酸受体GPR84为靶点的药物高通量筛选模型的建立和应用[J]. 张庆,杨慧,李佳,谢欣,李静. 生物化学与生物物理进展. 2015(04)
[7]胰高血糖素样肽1或其类似物体外生物活性检测方法的建立[J]. 邵妤,赵威,王微,曲国龙,阚乃鹏,凌婧怡,谭俊杰,刘刚,陈惠鹏. 生物技术通讯. 2015(01)
[8]化学污染的分类及防治方法[J]. 如风. 化工管理. 2014(07)
[9]欧美国家畜禽养殖业中雌激素管理法规及措施[J]. 冯成洪,林建德,邵坚,刘姝芳,杨明,李艳霞,张荣华. 环境污染与防治. 2011(12)
[10]不同类别食品中21种邻苯二甲酸酯的气相色谱-质谱测定及其分布情况研究[J]. 吴惠勤,朱志鑫,黄晓兰,林晓珊,黄芳,马叶芬,罗辉泰,邓欣,潘亮君. 分析测试学报. 2011(10)
硕士论文
[1]桑叶对肉羊生产性能、血液生化指标、免疫抗氧化功能和肉品质的影响[D]. 李伟玲.内蒙古农业大学 2012
本文编号：3102190
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