MACC1基因表达对非小细胞肺癌血管生成的影响及相关机制研究

发布时间：2017-04-17 05:01

  本文关键词：MACC1基因表达对非小细胞肺癌血管生成的影响及相关机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：研究MACC1、c-Met、微血管密度(Microvascular density, MVD)在NSCLC中的表达及相关性,探讨三者与NSCLC临床病理特征(特别是与淋巴结转移和血管生成)之间的关系；并进一步通过鸡胚尿囊膜实验和NSCLC细胞实验研究MACC1基因对NSCLC血管生成的影响及相关分子作用机制。方法：1.MACC1、c-Met、MVD在NSCLC中的表达及相关性研究,探讨三者与NSCLC临床病理特征之间的关系：收集手术切除后的NSCLC组织50例,采用免疫组织化学方法检测癌组织和癌旁正常组织中的MACC1、c-Met、MVD (CD34标记)表达情况,分析其与临床病理特征之间的关系及三者的相关性。2. NSCLC细胞系中MACC1的mRNA水平的测定：培养5株NSCLC细胞,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)方法检测MACC1基因在所培养的5株NSCLC细胞中的相对表达水平；3.沉默MACC1基因表达对NSCLC细胞促血管生成的影响及其作用机制研究：选择MACC1基因高表达肺癌细胞系XWLC-05,使用化学合成的MACC1-siRNA瞬时转染XWLC-05细胞,经相关检测有效沉默细胞中MACC1基因表达的基础上,分别于转染细胞0小时,24小时,48小时,72小时后收集培养细胞上清液,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中血管生成相关因子VEGF, bFGF, IL8的分泌水平,于转染72小时后收集各实验组细胞上清液,通过鸡胚尿囊膜实验检测各实验组血管生成情况,同时提取各实验组细胞总蛋白,Western-blot方法检测MACC1下游信号通路关键蛋白分子Met、p-MEK/MEK、p-Erk/Erk和p-Akt/Akt的相对表达量。4.MACC1基因过表达对非小细胞肺癌促血管生成的影响及其作用机制研究：搜索Genebank中人MACC1的基因序列,自Thermo Scientific公司购买MACC1 cDNA克隆质粒进行扩增,经双酶切后将目的基因MACC1序列克隆入带有绿色荧光蛋白报告基因的PIRES2-EGFP表达载体,经测序检测成功构建PIRES2-EGFP-MACC1表达质粒,将已构建成功的PIRES2-EGFP-MACC1表达载体瞬时转染人MACC1基因低表达肺腺癌细胞系SPC-A1,分别于转染细胞0小时,24小时,48小时,72小时后收集培养细胞上清液,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中血管生成相关因子VEGF, bFGF, IL8的分泌水平,于转染72小时后收集各实验组细胞上清液,通过鸡胚尿囊膜实验检测各实验组血管生成情况,同时提取各实验组细胞总蛋白,Western-blot方法检测MACC1下游信号通路关键蛋白分子Met、 p-MEK/MEK、p-Erk/Erk和p-Akt/Akt的相对表达量。结果：1.50例NSCLC组织中MACC1、c-Met阳性表达率分别为68%、64%,与相应癌旁正常组织阳性表达率(32%,36%)相比差异有统计学意义(P0.05); MACC1、c-Met阳性表达在NSCLC组织中表达呈正相关,与NSCLC的临床分期、有无淋巴结转移有关；NSCLC组织中MACC1、 c-Met阳性组MVD值高于MACC1、c-Met阴性的肺癌组织(P0.05),相关性分析得出MACC1、c-Met的表达与MVD值存在相关性(P0.05)；2. RT-qPCR显示五株NSCLC细胞中宣威肺腺癌细胞XWLC-05 MACC1 mRNA表达水平最高,肺腺癌细胞SPC-A1 MACC1 mRNA的表达水平最低；3.化学合成的3组MACC1-siRNA均能沉默XWLC-05细胞中MACC1基因的表达,选择抑制效率最高的MACC1-siRNA3组应用于后续实验,其结果提示：MACC1 siRNA转染XWLC-05细胞后,鸡胚尿膜囊实验显示MACC1-siRNA干扰组鸡胚尿囊膜新生血管面积较无义siRNA组及空白对照组减少(P0.05)：ELISA检测结果显示于48和72小时所提取细胞培养上清液中的VEGF、bFGF和IL-8细胞因子的表达水平明显被抑制(P0.05)；Western-blot检测结果显示NSCLC细胞中的Met、p-MEK和p-ERK表达水平显著降低(P0.05),但总MEK和ERK蛋白表达无明显差异,AKT及其磷酸化蛋白水平均未受影响。4.成功构建PIRES2-EGFP-MACC1表达载体,经测序鉴定序列完全正确,转染SPC-A1细胞后荧光显微镜下可见清晰的绿色荧光表达,RT-PCR检测结果显示转染PIRES2-EGFP-MACC1的SPC-A1细胞能够稳定表达MACC1 mRNA,与转染PIRES2-EGFP (Vector)组和空白对照组相比,转染PIRES2-EGFP-MACC1组SPC-A1细胞MACC1 mRNA的表达量明显增高,差异具有统计学意义(p0.05)。鸡胚尿膜囊实验显示转染PIRES2-EGFP-MACC1组可见稍多的血管分支,鸡胚尿囊膜新生血管面积较PIRES2-EGFP (Vector)组及空白对照组相比增多,差异具有统计学意义(p0.05)；Western-Blot检测结果显示PIRES2-EGFP-MACC1转染组SPC-A1细胞c-Met表达水平显著增加,MAPK信号通路的关键蛋白因子p-MEK和p-Erk略有增加(P0.05),总MEK和Erk蛋白量没有变化,而AKT及其磷酸化水平蛋白未受影响,ELISA结果显示与PIRES2-EGFP (Vector)组及空白对照组相比,转染PIRES2-EGFP-MACC1组SPC-A1细胞上清液中血管生成相关因子VEGF, bFGF和IL8的分泌水平在24小时时基本一致,但48h和72小时后上述三个因子的表达水平明显增长(P0.05)。结论：1.NSCLC组织中MACC1、c-Met在NSCLC发生和转移中可能起重要作用,结合临床分期对非小细胞肺癌患者病情评估及预后判断有一定的指导意义。2. NSCLC组织中MACC1、c-Met的表达与MVD值存在相关性,说明MACC1、c-Met的表达可能与NSCLC的血管生成有关。3.MACC1基因能够影响NSCLC细胞诱导鸡胚尿膜囊微血管形成的能力,其机制可能与MACC1通过影响NSCLC细胞中的HGF/c-Met及其下游MEK/ERK信号通路,调控细胞中血管生成相关因子VEGF、bFGF和IL8等分泌有关。
【关键词】：结肠癌转移相关基因 非小细胞肺癌 鸡胚尿膜囊实验 小干扰RNA MEK/ErkAKT 细胞因子
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 英文缩写词表(按照英文单词字母顺序排列)7-9
• 研究背景9-17
• 研究的意义9
• 国内外研究进展9-13
• 存在的问题13-14
• 参考文献14-17
• 技术路线图17-18
• 全文中文摘要18-21
• Abstract21-25
• 第一部分 ：MACC1在非小细胞肺癌临床组织样本和相关肺癌细胞中的表达情况25-52
• 中文摘要25-27
• ABSTRACT27-29
• 前言29-30
• 材料与方法30-38
• 结果38-44
• 讨论44-49
• 参考文献49-52
• 第二部分 siRNA沉默MACC1基因表达对人肺癌细胞促进血管形成的影响52-85
• 中文摘要52-54
• ABSTRACT54-56
• 前言56-57
• 材料与方法57-69
• 结果69-74
• 讨论74-80
• 参考文献80-85
• 第三部分 过表达MACC1基因对人NSCLC细胞促血管生成的影响85-124
• 中文摘要85-87
• ABSTRACT87-89
• 前言89
• 材料与方法89-105
• 结果105-117
• 讨论117-122
• 参考文献122-124
• 全文总结124-126
• 综述126-137
• 参考文献133-137
• 关于使用组织样本开展科学研究的知情同意书137-139
• 攻读博士期间发表的论文139-140
• 致谢140-141

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 胡兴胜;付曦;文世民;邹心怡;刘雨松;;MACC1和c-met在非小细胞肺癌中的表达及其预后价值[J];中国肺癌杂志;2012年07期

2 冯建国;南欣荣;;bFGF在口腔鳞状细胞癌中的组织分布及其表达[J];中国药物与临床;2008年05期

3 ;Inducing effects of hepatocyte growth factor on the expression of vascular endothelial growth factor in human colorectal carcinoma cells through MEK and PI3K signaling pathways[J];Chinese Medical Journal;2007年09期

4 俞维;焦娜;;HGF/c-Met信号通路与肿瘤的研究进展[J];中国误诊学杂志;2010年23期

5 刘宏侠;杨俊泉;汪宏斌;孙玉满;;非小细胞肺癌中c-Met蛋白的表达及预后意义[J];细胞与分子免疫学杂志;2010年10期

6 Wanqing Chen;Rongshou Zheng;Siwei Zhang;Ping Zhao;Hongmei Zeng;Xiaonong Zou;Jie He;;Annual report on status of cancer in China,2010[J];Chinese Journal of Cancer Research;2014年01期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 冯于玲;UGT1A1基因重组质粒的构建及鉴定[D];广西医科大学;2014年

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本文编号：312440