联合检测PTEN、VEGF和MVD在食管鳞状细胞癌的表达及其临床意义

发布时间：2017-04-18 19:06

  本文关键词：联合检测PTEN、VEGF和MVD在食管鳞状细胞癌的表达及其临床意义，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的世界范围内,超过80%的食管癌发生在发展中国家。根据2008年全球癌症统计报告数据显示[3],我国食管癌发病率位居世界第4位。根据2012年中国肿瘤登记年报,在我国食管癌发病率居恶性肿瘤的第5位,食管癌死亡率居恶性肿瘤的第4位。恶性肿瘤的发病是涉及到多种因素多个步骤的病理过程,是多种因素相互作用导致正常细胞恶变的结果,与自然环境、社会经济状况、生活条件、饮食习惯、年龄、机体免疫状态、遗传素质、致瘤性病毒等多种因素有关。近年来,由于分子生物学技术迅速发展,对癌细胞基因的研究不断深入,目前比较一致的看法为肿瘤的发生、发展是一个多基因、多阶段、多步骤渐进演化的过程,该过程涉及到众多癌基因的激活和抑基因的突变和失活,其中癌基因和抑癌基因是研究最多的两类基因,各种关键基因的改变是人类肿瘤形成和发展的基础。PTEN (phosphate and tensin homology deleted on chromose ten)是1997年3月发现的一种新型肿瘤抑制基因。研究发现,PTEN基因在人体多处组织,特别是心、脑、肺、肝及肾等组织中表达水平较高,PTEN基因在维持细胞的增殖、分化和凋亡平衡中起重要作用,并可能参与调节细胞生长,肿瘤浸润、转移和血管形成。随着研究的深入,先后有PTEN在子宫内膜癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌、胃癌、大肠癌等多种肿瘤组织中表达的报道,并发现PTEN基因与肿瘤的发生、浸润、转移及组织学分级有密切关系。癌基因的激活和(或)抑癌基因的突变、缺失、失活是各种肿瘤发生、发展的基础,主要表现为基因突变、异常甲基化、mRNA或蛋白表达降低或不表达等方式。研究发现,PTEN基因的突变及失活失去了对细胞生长的负调控作用,与多种恶性肿瘤的发生密切相关。PTEN的生物学功能主要有以下几点：1、抑制细胞的增殖、诱导细胞的凋亡。2、抑制细胞迁移及局部的黏附。3、参与胚胎的发育。4、抑制血管生成。5、维护免疫系统的稳定性。6、PTEN是造血干细胞的自我复制调节基因和白血病启动基因。目前认为,PTEN基因作用机制主要由以下三条途径共同完成：1、局灶黏附激酶(focal adhesion kinase, FAK)途径[20]。PTEN具有磷酸酶活性,可通过使FAK去磷酸化,抑制FAK活性,降低整合素介导的细胞扩散和局部黏附的形成,从而抑制细胞侵袭及转移。2、丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号途径[21-23]。PTEN对MAPK信号途径起负调节作用,可抑制肿瘤细胞生长。3、磷酯酰肌醇-3-磷酸(PIP3)途径。PTEN编码的蛋白具有脂质酸酶的活性,可降低PIP3水平,使细胞停止于G1期,从而诱导肿瘤细胞凋亡。恶性肿瘤的生长和转移必须依赖丰富的营养供给。如果无血管生成,体外培养的肿瘤组织生长体积不超过4mm3,体内肿瘤不超过1～2mm3。因此,血管生成是肿瘤生长和转移的必备条件,与肿瘤的发生、发展和转移有着密切关系。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth-factor, VEGF)及其受体(vascular endothelial growth-factor receptor, VEGFR)能特异地促进细胞分裂、增殖及迁移,在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用。VEGF是一种功能强大且能产生多种生物学效应的细胞因子,它是1989年Ferrarra在牛垂体滤泡星状细胞培养液中分离纯化出来的一类糖蛋白,是血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)家族的一个成员,广泛分布于人和动物体内的大脑、肾脏、肝脏、脾脏、胰腺和骨骼等组织中。VEGF相关基因家族包括6个分泌型的糖蛋白,分别为VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、 VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(placenta growth factor, PDGF),以及内分泌腺来源的血管内皮生长因子(endocrine gland derived vascular-endothelial growth factor, EG-VEGF)和5种类型血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth-factor receptor, VEGFR)。VEGF生物学功能有以下几点[25,26]：1、促进血管内皮细胞增殖。2、增加血管通透性。3、促进血管支持物的生成。4、抑制肿瘤细胞的凋亡。参与调控VEGF表达的相关因素主要包括以下几点[26-28]：1、缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)。2、激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1)。3、转录激活子3(signal transducer and activator of transcription3, STAT3)。4、刺激蛋白(stimulatory protein-1, SP-1)。5、基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)和CXCR4。6、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)。7、血小板。8、癌胚抗原相关的细胞粘附分子1 (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1, CEACAM1)。1971年,Folkman最早提出肿瘤生长是血管依赖性的,肿瘤细胞数量的增加(106个细胞以上)、病灶的增大,必须依赖肿瘤局部血管的新生。如果没有血管生成,肿瘤的生长将受到限制,由于没有足够的氧和营养供应,肿瘤细胞仅能通过弥散获得营养,肿瘤达到1～2 mm的直径或厚度后,即107个细胞左右将不再增大。一旦新生毛细血管长人肿瘤组织,肿瘤的营养供给即由弥散变为灌注,肿瘤生长就会加速。肿瘤的生长分为两个明显的阶段[30,31]：无血管期(avascular stage)和血管期(vascular stage)。在无血管期实体肿瘤的生长直径不会超过2mm,而这正是血液中氧和营养物质通过弥撒作用所能达到的距离。无血管期的肿瘤没有转移能力。从无血管期到血管期的转化称为“血管生成开关”。一但肿瘤经历“开关”转化就进入血管期,毛细血管的生成使肿瘤获得足够的血供和营养。肿瘤新生血管结构缺乏完整性,管壁薄弱,仅排列一层内皮细胞,缺乏平滑肌,基底膜变薄或者缺如,使它们比正常成熟血管更容易被肿瘤细胞穿透。另外,血管生成本身就具有一定的组织侵袭性,肿瘤细胞可以沿着新生血管所开启的胶原裂隙侵袭,也可以进入血液循环在远离肿瘤的部位形成转移灶。肿瘤血管生成是一个复杂的过程,主要以维持血管正常代谢的刺激因子之间的平衡被打破为主,表现在促血管生成因子的活性上调和(或)血管生成抑制因子的活性下调[32]。肿瘤细胞、内皮细胞和巨噬细胞受缺氧、系统刺激等使局部微环境发生变化的因素作用而合成和释放上述因子。当二者之间的平衡被打破,即发生肿瘤血管生成过程。其调控因素主要包括微血管生成因子和生成抑制因子。微血管生成因子包括[33]：血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、整合素、促血管生成素(angiopoietin, Ang)、胰岛素样生长因子Ⅱ(insulin-like growth factor Ⅱ, IGF-Ⅱ)。微血管生成抑制因子主要包括：血管抑制素(angiostatin)、内皮抑制素(endostatin)、血小板反应蛋白-1(TSP-1)、组织金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂与抑癌基因产物等[34]。微血管密度(microvessel density, MVD)或微血管记数(microvessel count, MVC)是肿瘤血管生成的标志。Weidner等报道了高倍视野下的血管数与肿瘤的生长具有相关性,并提出肿瘤组织微血管密度(Micro vessel Density, MVD)这一概念及测定方法,即与背景明显有别的内皮细胞或细胞簇团,只要与邻近血管、肿瘤细胞或其它结缔组织分开均看作一个微血管,管腔面积大于8个红细胞直径以及有较厚肌层的微血管均不计数,在“热点”区计数微血管数目。目前MVD计数方法以Weidner等建议的方案最具有代表性。MVD的标记物主要有以下几种：1、抗Ⅷ因子相关抗原抗体。2、血小板内皮细胞黏附分子(CD31)。3、CD34。4、CD105。新生血管多以免疫组化对内皮细胞进行染色,CD31标记微血管敏感、可靠,且背景清晰,交叉反应少,现多用于标记血管内皮细胞,从而计算MVD,进而判断肿瘤组织的血供情况,有助于判断肿瘤的进展状况。目前由于对食管癌的诊断及评估缺乏有效的检测手段,因此对食管癌发生、浸润转移的机制的探讨及对食管癌的诊断、评估已成为目前研究的热点之一。PTEN (phosphate and tensin homology deleted on chromose ten)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth-factor VEGF)和肿瘤组织微血管密度(Micro vessel density, MVD)与肿瘤的发生、发展密切相关,但联合检测PTEN、VEGF、MVD在食管鳞癌中表达的研究国内外文献报道较少。为研究PTEN、VEGF、MVD在食管鳞癌中是否存在表达以及其表达量的高低与其发生、浸润和转移是否存在关系,本文采用采用免疫组化SP法检测了50例食管癌及癌旁正常组织中PTEN、VEGF蛋白及MVD的表达,并探讨了PTEN与VEGF、MVD的相互关系。通过以上实验,试图阐明PTEN与VEGF蛋白及MVD的表达在食管鳞癌发生发展、浸润、转移中的意义,为进一步探讨食管鳞癌发生、浸润、转移机制及寻找抑制食管鳞癌发生、发展的途径提供理论基础。材料与方法选取50例南方医院和日照市人民医院2009.1-2014.1临床和病理资料完整的食管癌手术存档组织标本,每例标本均在癌灶及远端正常粘膜(病理证实为粘膜组织)处分别取材。采用免疫组化SP法分别检测了50例鳞癌及远端正常粘膜组织中PTEN、VEGF及MVD的表达情况,并对表达情况及三者之间的相关关系进行分析。结果1、食管鳞癌组织中PTEN蛋白表达率(54.0%)显著低于正常食管粘膜PTEN蛋白表达率(100.0%),经统计学分析,差异有显著统计学意义(P0.01)。Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级食管鳞癌组织的PTEN蛋白表达率随着癌组织分化程度降低而降低(Ⅰ级84.2%、Ⅱ级47.1%、Ⅲ级21.4%),经统计学分析,差异有显著统计学意义(P0.01)。浅层浸润组PTEN蛋白表达率(80.0%)高于深层浸润组PTEN蛋白阳性(40.0%),经统计学分析,差异有显著统计学意义(P0.01)。淋巴结转移组PTEN蛋白表达率(31.6%)明显低于无淋巴结转移组PTEN蛋白表达率(67.7%),经统计学分析,差异有统计学意义(P0.05)。2、癌旁正常粘膜的VEGF蛋白表达率(100%)显著高于鳞癌VEGF蛋白表达率(64.0%),经统计学分析,差异有显著统计学意义(P0.01)。Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级食管鳞癌组织VEGF蛋白表达率随癌组织分化程度的降低而呈升高趋势(Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级癌组织中分别为(52.6%、64.7%、78.6%),经统计学分析,差异无统计学意义(P0.05)。浅层浸润组的VEGF蛋白表达率(73.3%)高于深层浸润组VEGF蛋白表达率(60.0%),经统计学分析,差异无统计学意义(P0.05)。淋巴结转移组VEGF蛋白表达率(63.2%)稍低于非转移组VEGF蛋白表达率(64.5%),经统计学分析,差异无统计学意义(P0.05)。3、癌旁正常粘膜的MVD值(25.282±3.477)明显低于鳞癌的MVD值(42.224±9.3348),经统计学分析,差异有显著统计学意义(P0.01)。Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级食管鳞癌组织中MVD值随癌组织分化程度的降低而呈升高趋势(Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级癌组织中分别为34.8211±3.3186、40.5647±5.2354、54.2857±6.2518),经统计学分析,差异有显著统计学意义(P0.01)。深层浸润组的MVD值(43.4943±9.0385)高于浅层浸润组的MVD值(39.2600±9.6505),经统计学分析,差异无统计学意义(P0.05)。淋巴结转移组的MVD值(46.0053±8.4854)高于无淋巴结转移组的MVD值(39.9065±8.4854),经统计学分析,差异有统计学意义(P0.05)。4、PTEN蛋白表达阳性病例的VEGF蛋白阳性表达率(55.6%)低于PTEN蛋白表达阴性病例的VEGF蛋白的阳性表达率(73.9%),经统计学分析,差异无统计学意义(P0.05)。PTNE蛋白表达阳性病例的MVD值(38.76±7.96)低于PTEN蛋白表达阴性病例的MVD值(46.29±9.34),经统计学分析,差异有显著统计学意义(P0.01)。VEGF蛋白表达阳性病例的MVD值(46.33±8.99)高于VEGF蛋白表达阴性的病例的MVD值(34.92±3.92),经统计学分析,差异有显著统计学意义(P0.01)。结论1、食管鳞癌组织中PTEN蛋白表达低于正常食管粘膜PTEN蛋白表达；PTEN蛋白表达与食管鳞癌组织学分级、浸润深度及淋巴结转移有关。2、食管鳞癌组织中VEGF蛋白表达明显高于正常食管粘膜VEGF蛋白表达；但VEGF蛋白的阳性表达与食管鳞癌的组织学分级、浸润深度及淋巴结转移无关。3、食管鳞癌组织中MVD明显高于正常食管粘膜MVD,其表达与组织学分级及淋巴结转移有关,与浸润深度无关。4、PTEN蛋白的阳性表达与VEGF蛋白表达、MVD之间可能呈负相关关系；VEGF蛋白的表达与MVD可能呈正相关关系。5、联合检测PTEN、VEGF与MVD可作为判定食管鳞癌侵袭转移能力的一项客观指标,对食管鳞癌的预后判断具有重要意义。
【关键词】：食管鳞癌 PTEN VEGF MVD CD31
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 前言22-24
• 资料与方法24-27
• 1 实验材料24-25
• 1.1 纳入标准24
• 1.2 主要试剂24-25
• 2 方法25-26
• 2.1 组织标本处理25
• 2.2 免疫组化染色步骤25
• 2.3 对照组设计25-26
• 2.4 结果判断26
• 3 统计学处理26-27
• 结果27-35
• 1 PTEN、VEGF和MVD与食管鳞癌分化程度、浸润转移的关系27-31
• 1.1 PTEN蛋白的表达与食管鳞癌分化程度、浸润转移的关系27-29
• 1.2 VEGF蛋白的表达与食管鳞癌分化程度、浸润转移的关系29-30
• 1.3 MVD的表达与食管鳞癌分化程度、浸润转移的关系30-31
• 2. PTEN、VEGF蛋白表达与MVD相关性分析31-35
• 2.1 PTEN蛋白表达与VEGF蛋白表达的相关性分析31-32
• 2.2 PTEN蛋白表达与MVD的相关性分析32-33
• 2.3 VEGF蛋白的表达与MVD的相关性分析33-35
• 讨论35-78
• 1. PTEN蛋白的表达与食管鳞癌分化程度、浸润和转移的关系35-48
• 1.1 PTEN结构特征35-37
• 1.2 PTEN生物学功能37-40
• 1.3 PTEN作用机制40-42
• 1.4 PTEN基因失活类型及治疗方法42-47
• 1.5 PTEN在食管鳞癌中的表达及意义47-48
• 2. VEGF蛋白的表达与食管鳞癌分化程度、浸润和转移的关系48-60
• 2.1 VEGF相关成员及其结构特征50-53
• 2.2 VEGF的生物学功能53-55
• 2.3 调控VEGF表达的相关因素及作用机制55-59
• 2.4 VEGF在食管鳞癌中的表达及临床意义59-60
• 3. MVD的表达与食管鳞癌分化程度、浸润和转移的关系60-73
• 3.1 肿瘤微血管形态、来源及分布特点61-62
• 3.2 肿瘤微血管生成及调控机制62-69
• 3.3 MVD计数方法及常用标志69-70
• 3.4 MVD在食管鳞癌中的表达及临床意义70-73
• 4. PTEN、VEGF蛋白表达和MVD的相关性分析73-78
• 4.1 PTEN与VEGF相关性分析73-75
• 4.2 PTEN与MVD相关性分析75-76
• 4.3 VEGF与MVD相关性分析76-78
• 参考文献78-96
• 附录96-99
• 攻读学位期间成果99-100
• 缩写词简表100-101
• 致谢101-103
• 统计学审稿证明103

  本文关键词：联合检测PTEN、VEGF和MVD在食管鳞状细胞癌的表达及其临床意义，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：315532