Mdm2-p53信号通路调控及p53抑制肿瘤转移的机制研究

发布时间：2021-04-30 09:29

　　p53作为一个重要的抑癌蛋白,其蛋白水平在细胞内需要受到严格的调控。作为体内最为关键的p53负调因子,E3泛素连接酶Mdm2能够结合并催化p53发生多聚泛素化修饰,进而促使p53通过蛋白酶体途径降解。在我们的研究中,我们鉴定了 MARCH7是Mdm2一个新的相互作用蛋白。有意思的是,和传统E3泛素连接酶介导底物降解的作用不同,MARCH7作为一个E3泛素连接酶能够稳定Mdm2的蛋白水平。MARCH7也能够通过稳定Mdm2,进而促进p53多聚泛素化和蛋白降解。在分子机制上,我们发现MARCH7能够在体内外特异性地催化Mdm2形成K63-依赖的多聚泛素链,进而抑制Mdm2的自身泛素化和降解。在功能上,MARCH7能够通过调控p53的表达水平,从而控制细胞增殖、细胞凋亡、克隆形成以及裸鼠移植瘤生长。我们的这一工作揭示了一种全新的Mdm2蛋白稳定性调控模式,并表明MARCH7是Mdm2-p53通路的一个重要调控因子。p53作为抑癌蛋白在肿瘤发生发展过程中起着关键的调控作用。虽然p53抑制肿瘤转移的功能已被人们逐渐认识,然而其潜在的分子机制目前仍然不是很明确。在我们的另一项研究中,我们鉴定了一个... 

【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：111 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 癌症与健康
    1.2 p53与肿瘤
    1.3 Mdm2与肿瘤
    1.4 MARCH7研究进展
    1.5 Arp2/3复合体研究进展
    1.6 研究的内容与意义
第二章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞及小鼠来源
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验仪器
        2.1.4 抗体
        2.1.5 引物
    2.2 细胞培养
    2.3 质粒构建
        2.3.1 目的条带扩增
        2.3.2 琼脂糖凝胶电泳
        2.3.3 PCR产物胶回收
        2.3.4 目的片段双酶切及连接
        2.3.5 转化及单克隆鉴定
        2.3.6 大肠杆菌感受态制备
        2.3.7 shRNA质粒构建
        2.3.8 Axygen质粒小量提取试剂盒抽提质粒
        2.3.9 碱法质粒粗提
    2.4 蛋白质印记
    2.5 实时荧光定量PCR
        2.5.1 总RNA提取
        2.5.2 RNA逆转录成cDNA
        2.5.3 实时荧光定量PCR
    2.6 质粒转染与病毒感染
        2.6.1 质粒瞬时转染
        2.6.2 病毒感染
    2.7 免疫共沉淀
    2.8 蛋白表达及纯化
    2.9 体内外泛素化实验
        2.9.1 体内泛素化实验
        2.9.2 体外泛素化实验
    2.10 荧光素酶报告基因检测
    2.11 免疫荧光实验
    2.12 软琼脂克隆形成实验
    2.13 裸鼠成瘤实验
    2.14 GST pull-down实验
    2.15 染色体免疫沉淀（CHIP)实验
    2.16 Pyrene actin聚合实验
    2.17 Actin负染电镜观察
        2.17.1 Actin聚合反应
        2.17.2 负染电镜观察actin分支情况
    2.18 细胞迁移和细胞侵袭实验
    2.19 单细胞追踪实验
    2.20 体内肿瘤转移实验
    2.21 数据重复性和统计分析
第三章 结果与讨论
    第一部分 MARCH7调控Mdm2-p53信号通路
        3.1 MARCH7是Mdm2的互作蛋白
            3.1.1 MARCH7与Mdm2在体内外相互作用
            3.1.2 MARCH7与Mdm2结合的区段分析
        3.2 MARCH7增加Mdm2的蛋白稳定性
            3.2.1 MARCH7增加野生型Mdm2蛋白水平
            3.2.2 MARCH7调节Mdm2稳定性
        3.3 MARCH7促进Mdm2依赖的p53多聚泛素化和降解
            3.3.1 MARCH7调节Mdm2-p53信号轴
            3.3.2 MARCH7通过Mdm2调节p53多聚泛素化和降解
            3.3.3 MARCH7调节p53转录活性
        3.4 MARCH7催化Mdm2形成K63连接的多聚泛素化
            3.4.1 MARCH7增强Mdm2 C464A多聚泛素化
            3.4.2 MARCH7能够促进Mdm2 K63连接的多聚泛素链形成
        3.5 MARCH7以p53依赖的方式调节细胞增殖、细胞凋亡和肿瘤发生
            3.5.1 MARCH7以p53依赖的方式调节细胞增殖
            3.5.2 MARCH7调控Mdm2本底水平控制p53对DNA损伤的响应
            3.5.3 MARCH7调控p53介导的细胞凋亡
            3.5.4 MARCH7调控p53介导的肿瘤发生
        3.6 讨论
    第二部分 WDR63介导p53抑制肿瘤转移
        4.1 WDR63抑制细胞迁移、细胞侵袭和肿瘤转移
            4.1.1 WDR63抑制细胞划痕愈合和迁移
            4.1.2 WDR63抑制细胞侵袭
            4.1.3 WDR63抑制肿瘤转移
            4.1.4 WDR63不影响细胞增殖、凋亡和周期阻滞
        4.2 WDR63是p53直接的转录靶标
            4.2.1 p53正向调控WDR63的表达
            4.2.2 p53直接转录调控WDR63
        4.3 WDR63与Arp2/3复合体相互作用
            4.3.1 WDR63与Arp2在体内外相互作用
            4.3.2 WDR63是Arp2/3复合体的新型结合蛋白
        4.4 WDR63抑制Arp2/3介导的actin聚合
            4.4.1 WDR63抑制Arp2/3介导的actin聚合
            4.4.2 WDR63与VCA竞争结合Arp2/3复合体
        4.5 WDR63通过Arp2/3复合体抑制细胞迁移和细胞侵袭
            4.5.1 WDR63通过Arp2/3抑制细胞迁移和细胞侵袭
            4.5.2 与Arp2/3复合体结合是WDR63抑制细胞迁移和细胞侵袭必须的
        4.6 WDR6介导p53抑制细胞迁移、细胞侵袭和转移功能
        4.7 讨论
参考文献
致谢
在读期间发表的论文及取得的成果



本文编号：3169270