基于新型单链接头的NGS文库制备新技术及其应用研究

发布时间：2021-05-09 02:26

　　过去的十年间,表观遗传的异常能够导致癌症是在癌症研究方面取得的最令人瞩目的成就。染色质开放状态作为一种重要的表观遗传信息,在癌症的发生发展过程中起着重要的作用。呈开放状态的染色质区域为转录因子（transcription20factor,TF）的结合提供了可能,而转录因子通过调控基因的表达同样也在癌症过程中有着关键作用。因此,对癌症细胞的染色质开放状态以及与之相结合的转录因子的结合特征进行分析对于认识和治疗癌症都具有重要意义。游离DNA（cell20free20DNA,cfDNA）作为液体活检的重要材料来源,在癌症相关的突变检测中发挥着重要作用。进一步拓展cfDNA的应用范围,使其能够用于染色质开放状态的检测,成为癌症诊断更加有力的工具,在癌症检测领域也具有极大的应用价值。而二代测序技术（next-generation20sequencing,NGS）在上述研究中均发挥着重要作用。本研究针对上述几方面展开研究,开发出研究染色质开放状态、cfDNA的新方法,并对NF-κB在HeLa细胞中的结合特征进行了分析,取得以下结果:1.高通量鉴定染色质开放状态的SALP方法建立NGS是当前生物和生... 

【文章来源】：东南大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：144 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 二代测序技术
    1.2 染色质开放状态
        1.2.1 染色质的结构
        1.2.2 染色质开放状态概述
        1.2.3 染色质开放状态与癌症
        1.2.4 染色质开放状态的研究方法
    1.3 转录因子
        1.3.1 转录因子概述
        1.3.2 转录因子与癌症
        1.3.3 转录因子结合位点的研究方法
    1.4 游离DNA
        1.4.1 游离DNA概述
        1.4.2 循环肿瘤DNA
        1.4.3 游离DNA研究方法
    1.5 本论文研究内容和意义
第二章 高通量鉴定染色质开放状态的NGS建库新方法建立
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 主要试剂材料及仪器
        2.2.2 细胞培养
        2.2.3 不同接头的制备
        2.2.4 Tn5转座体的制备
        2.2.5 基因组DNA的片段化
        2.2.6 SALP单链接头的优化
        2.2.7 利用SALP制备不同细胞tagmented染色质NGS文库
        2.2.8 SALP利用Hind Ⅲ和超声打断DNA制备NGS文库
        2.2.9 Next-generation测序
        2.2.10 SALP-seq数据分析
        2.2.11 数据可用性
    2.3 结果与分析
        2.3.1 基于tagmentation的 SALP方法的开发
        2.3.2 通过SALP高通量的制备基于tagmentation NGS文库
        2.3.3 通过SALP-seq鉴定淋巴母细胞的染色质开放状态
        2.3.4 SALP-seq鉴定不同细胞系的染色质开放状态
        2.3.5 SALP-seq鉴定潜在的癌症相关基因
        2.3.6 SALP-seq比较调控区的染色质开放状态
        2.3.7 SALP-seq通过不同细胞数量鉴定染色质开放状态
        2.3.8 SALP-seq以酶切或超声片段化基因组DNA构建NGS文库
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
第三章 利用SALP-seq绘制多种细胞的染色质开放谱
    3.1 引言
    3.2 材料方法
        3.2.1 主要试剂材料及仪器
        3.2.2 细胞培养
        3.2.3 不同接头的制备
        3.2.4 Tn5转座体的制备
        3.2.5 小鼠肝脏单细胞分离
        3.2.6 利用SALP制备不同细胞tagmented染色质NGS文库
        3.2.7 Next-generation测序
        3.2.8 SALP-seq数据分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 多种细胞SALP-seq文库构建及测序
        3.3.2 正常细胞与癌症细胞之间染色质开放状态比较
        3.3.3 不同癌症细胞之间染色质开放状态比较
        3.3.4 人正常肝脏细胞与肝癌细胞染色质开放状态比较
        3.3.5 人成纤维细胞与正常肝脏细胞染色质开放状态比较
        3.3.6 不同宫颈癌细胞染色质开放状态比较
        3.3.7 突变热点染色质开放状态比较
        3.3.8 小鼠正常肝脏细胞与肝癌细胞染色质状态比较
    3.4 讨论
    3.5 本章小结
第四章 用改进的SALP-seq解析游离DNA中的遗传和表观遗传信息
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 主要试剂材料及仪器
        4.2.2 样本收集
        4.2.3 游离DNA提取
        4.2.4 接头制备
        4.2.5 用改进的SALP方法制备cf DNA NGS文库
        4.2.6 NGS测序
        4.2.7 cfDNA测序数据分析
        4.2.8 遵守道德标准
        4.2.9 数据可用性
    4.3 结果与分析
        4.3.1 运用改进的SALP-seq构建cf DNA NGS文库
        4.3.2 cfDNA的特征分析
        4.3.3 运用cfDNA鉴定染色质状态
        4.3.4 通过cfDNA鉴定激活基因
        4.3.5 通过cfDNA鉴定突变
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
第五章 人宫颈癌细胞中NF-κB结合特征鉴定
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 主要试剂材料及仪器
        5.2.2 细胞培养和处理
        5.2.3 ChIP-exo和数据分析
        5.2.4 凝胶迁移实验
        5.2.5 荧光素酶报告基因实验
        5.2.6 ChIP-clone数据分析
        5.2.7 ChIP-seq数据分析
        5.2.8 分析全基因组范围内κB位点的分布
    5.3 结果与分析
        5.3.1 在He La细胞中NF-κB能够与nt-κB位点结合
        5.3.2 检测NF-κB与 nt-κB位点结合及其转录活性
        5.3.3 淋巴母细胞系中NF-κB与 nt-κB的结合
        5.3.4 内皮细胞系中NF-κB与 nt-κB的结合
        5.3.5 细胞被诱导前后NF-κB与 nt-κB位点的结合情况
    5.4 讨论
    5.5 本章小结
第六章 总结与展望
参考文献
作者简介
致谢



本文编号：3176435