基于纳米材料质谱法对人乳头瘤状病毒分型及检测方法研究
发布时间：2021-05-20 01:28
宫颈癌是全球女性中第四大常见的癌症,已有研究表明持续性感染高危型人乳头瘤状病毒（HPV）病毒是宫颈病变的必要条件。早期感染HPV不会产生任何症状,这是因为HPV L1蛋白是保护性抗原,可激发人自身的免疫系统而清除病毒,又因为HPV L1蛋白是晚期产生的蛋白,主要存在病毒复制期,所以检测HPV L1蛋白能反应患者的免疫状态和HPV DNA是否整合到宿主基因组,从而判断病情发展趋势以及是否能引起恶性病变。不同宫颈癌变的级别与HPV感染型别存在一定差异,人们常常根据患者携带病毒的量来辨别病情,预测宫颈恶性病变的风险,因此当已经确证持续感染HPV后,我们既要根据感染HPV的型别,又要根据患者携带病毒的量,来评判和预测与HPV病毒有关疾病的发展趋势,做到早预防早治疗,降低发病率和死亡率。综上HPV分型检测对早期宫颈癌的筛查起着重要作用,而检测HPV L1蛋白对宫颈疾病发展趋势的预测和HPV感染治疗的预后都具有很大的参考意义,二者结合起来对临床诊断更具实用价值。同时进行HPV分型和HPV L1蛋白检测可弥补彼此的缺点,临床上可极大降低漏诊误诊率,提高恶性病变诊断和预测的准确性,最大程度减少患者的损...
【文章来源】：北京化工大学北京市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：125 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
学位论文数据集
摘要
Abstract
符号说明
第一章 绪论
1.1 人乳头瘤状病毒(HPV)概述
1.1.1 人乳头瘤状病毒（HPV)结构
1.1.2 人乳头瘤状病毒（HPV)基因组与功能
1.1.3 HPV病毒分型
1.1.4 HPV与肿瘤的关系
1.1.5 HPV的致病机理
1.1.6 HPV病毒载量与宫颈癌的关系
1.1.7 HPV分型检测的意义
1.1.8 HPV L1蛋白检测的意义
1.1.9 HPV分型联合HPV L1蛋白检测的意义
1.1.10 HPV检测方法
1.1.10.1 细胞学检查
1.1.10.2 杂交捕获二代分析（HC2)
1.1.10.3 基于聚合酶链式反应(PCR)的检测方法
1.1.10.4 基因芯片技术
1.2 基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI TOF MS)
1.2.1 MALDI TOF MS基本原理
1.2.2 MALDI电离机理
1.2.3 MALDI TOF MS的应用
1.2.3.1 多肽与蛋白质分析
1.2.3.2 多磷酸化肽分析检测
1.2.3.3 寡核苷酸分析检测
1.2.3.4 MALDI定量分析
1.2.3.5 MALDI TOF MS对HPV检测
1.3 本论文研究的目的、意义和主要内容
1.3.1 本论文研究目的和意义
1.3.2 本论文研究内容
第二章 高效富集寡核苷酸纳米材料的制备
2.1 引言
2.2 实验部分
2.2.1 试剂与仪器
2.2.2 精胺修饰纳米金刚石的制备
2.2.3 红外光谱和红外成像的表征
2.2.4 SP-NDs对寡核苷酸的吸附效果
2.2.5 SP-NDs富集稀溶液及复杂基质中的寡核苷酸
2.2.6 MADLI TOF MS分析
2.3 结果与讨论
2.3.1 SP-NDs的表征
2.3.2 SP-NDs对寡核苷酸的吸附
2.3.3 MALDI TOF MS分析稀溶液寡核苷酸
2.3.4 MALDI TOF MS分析复杂基体中的寡核苷酸
2.4 本章小结
第三章 基于纳米材料高效富集质谱法对HPV病毒分型研究
3.1 引言
3.2 实验部分
3.2.1 试剂与仪器
3.2.2 HPV通用引物PCR扩增
3.2.3 巢式PCR-RFLP方法
3.2.4 临床样品DNA提取
3.2.5 MALDI TOF MS检测酶切产物
3.2.6 试剂盒检测临床样本
3.3 结果与讨论
3.3.1 HPV限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFMP)
3.3.2 MALDI TOF MS对HPV分型检测
3.3.3 临床样品验证结果
3.4 本章小结
第四章 基于纳米金非共价键竞争吸附质谱法定量检测HPV16 L1蛋白
4.1 引言
4.2 实验部分
4.2.1 试剂与仪器
4.2.2 纳米金的合成
4.2.3 纳米金表征
4.2.4 纳米金聚集盐的浓度
4.2.5 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合
4.2.5.1 溶液配制
4.2.5.2 pH值的影响
4.2.5.3 盐的影响
4.2.5.4 吸附时间
4.2.5.5 AuNPs与核酸适配体比例
4.2.5.6 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物稳定性
4.2.5.7 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物的表征
4.2.7 Mass Tag的筛选
4.2.7.1 确定Mass tag与AuNPs的亲和力
4.2.7.2 Mass Tag和HPV16 L1核酸适配体竞争吸附
4.2.8 HPV16 L1蛋白的检测
4.2.9 HPV16 L1蛋白的检测特异性
4.2.10 样本检测
4.2.10.1 标准曲线的建立
4.2.10.2 样本前处理和检测
4.2.11 方法学验证
4.2.11.1 方法重现性
4.2.11.2 方法回收率
4.2.12 酶联免疫(ELISA)试剂盒检测样本
4.3 结果与讨论
4.3.1 纳米金的表征
4.3.2 纳米金聚集盐的浓度
4.3.3 AuNPs吸附Aptamer条件
4.3.3.1 pH的影响
4.3.3.2 盐的影响
4.3.3.3 吸附时间的影响
4.3.3.4 AuNPs与核酸适配体比例
4.3.3.5 AuNPs-APT_(HPV16 L1)稳定性研究
4.3.4 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物的表征
4.3.5 质量标签(Tag)的筛选
4.3.6 MALDI TOF MS条件
4.3.6.1 检测模式
4.3.6.2 基质的选择
4.3.7 HPV16 L1蛋白的检测
4.3.8 方法分析表现
4.3.9 实际样品的定量分析
4.3.10 ELISA实验验证
4.4 本章小结
第五章 基于氧化石墨烯和核酸适配体竞争吸附检测HPV 16 L1蛋白
5.1 引言
5.2 实验部分
5.2.1 试剂与仪器
5.2.2 离心时间
5.2.3 氯化钠浓度
5.2.4 HPV16 L1核酸适配体浓度
5.2.5 HPV16 L1蛋白检测
5.2.6 临床样本检测
5.2.7 特异性实验
5.2.8 基于核酸适配体与GO检测体系Zeta电势和颗粒尺寸分布研究
5.3 结果与讨论
5.3.1 离心时间的影响
5.3.2 氯化钠浓度的影响
5.3.3 HPV16 L1核酸适配体的浓度
5.3.4 HPV 16 L1蛋白检测
5.3.5 实际临床样本检测
5.3.6 回收率
5.3.7 特异性实验
5.3.8 GO/HPV 16 L1核酸适配体检测体系颗粒尺寸的分布研究
5.3.9 HPV 16 L1核酸适配体和GO检测体系Zeta电势分布
5.3.10 与第四章所建立的方法比较
5.4 本章小结
第六章 结论与展望
参考文献
致谢
研究成果及发表的学术论文
作者和导师简介
附件
【参考文献】：
期刊论文
[1]子宫颈液基细胞学检查异常的涂片中人乳头状瘤病毒L1蛋白的表达及其意义[J]. 肖巍,卞美璐,马莉,刘军,陈颖. 中华妇产科杂志. 2009 (12)
[2]高危型人乳头瘤病毒负荷量与宫颈癌及癌前病变的相关性研究[J]. 岑坚敏,钱德英,曾仁海,王丁,林爱华,赵杨,舒焰红. 中国实用妇科与产科杂志. 2007(07)
[3]基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于人参皂甙Rg3的定量分析[J]. 袁湘林,张玉奎,邹汉法. 分析化学. 2001(01)
[4]基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于寡糖的分析[J]. 袁湘林,邹汉法,汪海林,倪坚毅,张玉奎. 分析化学. 1999(07)
[5]基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱及其在高分子量物质测定中的应用[J]. 袁湘林,邹汉法,张玉奎. 分析化学. 1998(02)
[6]人乳头状瘤病毒及其L1蛋白检测在宫颈病变诊断中的应用[J]. 史健,邓宽国,刘玉霞,尹石华. 医学检验与临床. 2010 (06)
硕士论文
[1]HPV基因分析在宫颈上皮内瘤变中的作用和意义[D]. 崔虹飞.青岛大学 2013
[2]利用SELEX技术筛选高危型HPVL1蛋白适体的研究与探讨[D]. 肖昕.华中科技大学 2012
[3]原位MALDI-MS辅助宫颈细胞学诊断方法的建立[D]. 王燕.北京协和医学院 2010
[4]宫颈癌盆腔淋巴结HPV DNA检测的临床意义[D]. 马玎.青岛大学 2009
本文编号：3196813
【文章来源】：北京化工大学北京市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：125 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
学位论文数据集
摘要
Abstract
符号说明
第一章 绪论
1.1 人乳头瘤状病毒(HPV)概述
1.1.1 人乳头瘤状病毒（HPV)结构
1.1.2 人乳头瘤状病毒（HPV)基因组与功能
1.1.3 HPV病毒分型
1.1.4 HPV与肿瘤的关系
1.1.5 HPV的致病机理
1.1.6 HPV病毒载量与宫颈癌的关系
1.1.7 HPV分型检测的意义
1.1.8 HPV L1蛋白检测的意义
1.1.9 HPV分型联合HPV L1蛋白检测的意义
1.1.10 HPV检测方法
1.1.10.1 细胞学检查
1.1.10.2 杂交捕获二代分析（HC2)
1.1.10.3 基于聚合酶链式反应(PCR)的检测方法
1.1.10.4 基因芯片技术
1.2 基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI TOF MS)
1.2.1 MALDI TOF MS基本原理
1.2.2 MALDI电离机理
1.2.3 MALDI TOF MS的应用
1.2.3.1 多肽与蛋白质分析
1.2.3.2 多磷酸化肽分析检测
1.2.3.3 寡核苷酸分析检测
1.2.3.4 MALDI定量分析
1.2.3.5 MALDI TOF MS对HPV检测
1.3 本论文研究的目的、意义和主要内容
1.3.1 本论文研究目的和意义
1.3.2 本论文研究内容
第二章 高效富集寡核苷酸纳米材料的制备
2.1 引言
2.2 实验部分
2.2.1 试剂与仪器
2.2.2 精胺修饰纳米金刚石的制备
2.2.3 红外光谱和红外成像的表征
2.2.4 SP-NDs对寡核苷酸的吸附效果
2.2.5 SP-NDs富集稀溶液及复杂基质中的寡核苷酸
2.2.6 MADLI TOF MS分析
2.3 结果与讨论
2.3.1 SP-NDs的表征
2.3.2 SP-NDs对寡核苷酸的吸附
2.3.3 MALDI TOF MS分析稀溶液寡核苷酸
2.3.4 MALDI TOF MS分析复杂基体中的寡核苷酸
2.4 本章小结
第三章 基于纳米材料高效富集质谱法对HPV病毒分型研究
3.1 引言
3.2 实验部分
3.2.1 试剂与仪器
3.2.2 HPV通用引物PCR扩增
3.2.3 巢式PCR-RFLP方法
3.2.4 临床样品DNA提取
3.2.5 MALDI TOF MS检测酶切产物
3.2.6 试剂盒检测临床样本
3.3 结果与讨论
3.3.1 HPV限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFMP)
3.3.2 MALDI TOF MS对HPV分型检测
3.3.3 临床样品验证结果
3.4 本章小结
第四章 基于纳米金非共价键竞争吸附质谱法定量检测HPV16 L1蛋白
4.1 引言
4.2 实验部分
4.2.1 试剂与仪器
4.2.2 纳米金的合成
4.2.3 纳米金表征
4.2.4 纳米金聚集盐的浓度
4.2.5 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合
4.2.5.1 溶液配制
4.2.5.2 pH值的影响
4.2.5.3 盐的影响
4.2.5.4 吸附时间
4.2.5.5 AuNPs与核酸适配体比例
4.2.5.6 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物稳定性
4.2.5.7 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物的表征
4.2.7 Mass Tag的筛选
4.2.7.1 确定Mass tag与AuNPs的亲和力
4.2.7.2 Mass Tag和HPV16 L1核酸适配体竞争吸附
4.2.8 HPV16 L1蛋白的检测
4.2.9 HPV16 L1蛋白的检测特异性
4.2.10 样本检测
4.2.10.1 标准曲线的建立
4.2.10.2 样本前处理和检测
4.2.11 方法学验证
4.2.11.1 方法重现性
4.2.11.2 方法回收率
4.2.12 酶联免疫(ELISA)试剂盒检测样本
4.3 结果与讨论
4.3.1 纳米金的表征
4.3.2 纳米金聚集盐的浓度
4.3.3 AuNPs吸附Aptamer条件
4.3.3.1 pH的影响
4.3.3.2 盐的影响
4.3.3.3 吸附时间的影响
4.3.3.4 AuNPs与核酸适配体比例
4.3.3.5 AuNPs-APT_(HPV16 L1)稳定性研究
4.3.4 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物的表征
4.3.5 质量标签(Tag)的筛选
4.3.6 MALDI TOF MS条件
4.3.6.1 检测模式
4.3.6.2 基质的选择
4.3.7 HPV16 L1蛋白的检测
4.3.8 方法分析表现
4.3.9 实际样品的定量分析
4.3.10 ELISA实验验证
4.4 本章小结
第五章 基于氧化石墨烯和核酸适配体竞争吸附检测HPV 16 L1蛋白
5.1 引言
5.2 实验部分
5.2.1 试剂与仪器
5.2.2 离心时间
5.2.3 氯化钠浓度
5.2.4 HPV16 L1核酸适配体浓度
5.2.5 HPV16 L1蛋白检测
5.2.6 临床样本检测
5.2.7 特异性实验
5.2.8 基于核酸适配体与GO检测体系Zeta电势和颗粒尺寸分布研究
5.3 结果与讨论
5.3.1 离心时间的影响
5.3.2 氯化钠浓度的影响
5.3.3 HPV16 L1核酸适配体的浓度
5.3.4 HPV 16 L1蛋白检测
5.3.5 实际临床样本检测
5.3.6 回收率
5.3.7 特异性实验
5.3.8 GO/HPV 16 L1核酸适配体检测体系颗粒尺寸的分布研究
5.3.9 HPV 16 L1核酸适配体和GO检测体系Zeta电势分布
5.3.10 与第四章所建立的方法比较
5.4 本章小结
第六章 结论与展望
参考文献
致谢
研究成果及发表的学术论文
作者和导师简介
附件
【参考文献】：
期刊论文
[1]子宫颈液基细胞学检查异常的涂片中人乳头状瘤病毒L1蛋白的表达及其意义[J]. 肖巍,卞美璐,马莉,刘军,陈颖. 中华妇产科杂志. 2009 (12)
[2]高危型人乳头瘤病毒负荷量与宫颈癌及癌前病变的相关性研究[J]. 岑坚敏,钱德英,曾仁海,王丁,林爱华,赵杨,舒焰红. 中国实用妇科与产科杂志. 2007(07)
[3]基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于人参皂甙Rg3的定量分析[J]. 袁湘林,张玉奎,邹汉法. 分析化学. 2001(01)
[4]基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于寡糖的分析[J]. 袁湘林,邹汉法,汪海林,倪坚毅,张玉奎. 分析化学. 1999(07)
[5]基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱及其在高分子量物质测定中的应用[J]. 袁湘林,邹汉法,张玉奎. 分析化学. 1998(02)
[6]人乳头状瘤病毒及其L1蛋白检测在宫颈病变诊断中的应用[J]. 史健,邓宽国,刘玉霞,尹石华. 医学检验与临床. 2010 (06)
硕士论文
[1]HPV基因分析在宫颈上皮内瘤变中的作用和意义[D]. 崔虹飞.青岛大学 2013
[2]利用SELEX技术筛选高危型HPVL1蛋白适体的研究与探讨[D]. 肖昕.华中科技大学 2012
[3]原位MALDI-MS辅助宫颈细胞学诊断方法的建立[D]. 王燕.北京协和医学院 2010
[4]宫颈癌盆腔淋巴结HPV DNA检测的临床意义[D]. 马玎.青岛大学 2009
本文编号：3196813
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