肿瘤血管靶向肽GX1用于胃癌的分子影像研究

发布时间：2017-04-23 04:06

  本文关键词：肿瘤血管靶向肽GX1用于胃癌的分子影像研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:胃癌是常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率居高不下,给我国造成了巨大的经济损失。其防治的关键是早发现早治疗,而我国胃癌的早诊率较低,致使病人确诊时已是中晚期,延误了手术时机。分子影像的出现为胃癌的诊治提供了新的思路,其关键是找到一个具有靶向特异性的分子。肿瘤血管靶向多肽的研究应用是目前国际公认的有效方法,利用噬菌体肽库筛选出肿瘤血管靶向肽有些已经进入临床试验阶段,具有良好的应用价值。我课题组一直致力于胃癌血管生成的研究,并在前期筛选出了肿瘤血管靶向性多肽GX1,研究显示其可以特异性地与肿瘤血管内皮细胞结合,并在体内具有一定的肿瘤靶向作用。利用GX1我们制备了一系列探针或药物,在胃癌的诊断和治疗方面做了大量研究,显示出了GX1的应用前景。但是GX1的亲和力及靶向性仍不足,我们又对其进行了修饰,以期弥补这些不足。本文即是将GX1制成二聚体,利用多种方法鉴定其体内外的特征,为胃癌的诊治提供一条新的思路。目的:1)合成GX1的二聚体,鉴定其是否亲和力及靶向性优于单体;2)摸索188Re的标记方法,制备188Re-PEG-(GX1)2,将其用于胃癌的SPECT成像,研究其用于胃癌诊断及治疗的可行性;3)摸索68Ga的标记方法,制备68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2,将其用于胃癌的PET成像,研究其用于胃癌诊断的可行性;方法:1)制备188Re-PEG-(GX1)2并做质量鉴定,测定标记率和稳定性;体外细胞结合分析及竞争性抑制实验验证188Re-PEG-(GX1)2与Co-HUVECs结合的特异性,判断GX1二聚体的亲和力是够增加;MTT分析及流式细胞术验证188Re-PEG-(GX1)2抑制Co-HUVECs增殖、诱导细胞凋亡的作用;2)荷瘤裸鼠的SPECT成像及T/H定量验证188Re-PEG-(GX1)2的在体靶向性;BLI监测荷瘤裸鼠的肿瘤生长,判断188Re-PEG-(GX1)2的治疗效果;3)离体肿瘤组织的CD 31染色、Ki 67染色、TUNEL等验证188Re-PEG-(GX1)2抑制肿瘤血管生成、抑制细胞增殖及诱导凋亡作用;对肝、肾的HE染色及生化分析判断188Re-PEG-(GX1)2对肝、肾功能的影响。4)制备68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2并做质量鉴定,测定标记率和稳定性;体外细胞结合分析及竞争性抑制实验验证68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2与Co-HUVECs结合的特异性;细胞免疫荧光和摄取及外排实验判断GX1二聚体的亲和力是够增加;5)Nano PET/CT成像、SUV值定量、生物学分布等实验验证68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2在荷瘤裸鼠体内的肿瘤靶向性,定量分析其在体分布。结果:1)成功制备了188Re-PEG-(GX1)2,标记率大于96%,在血清中72 h稳定存在;体外细胞结合分析及竞争性抑制实验结果表明188Re-PEG-(GX1)2能够与Co-HUVECs特异性结合,且亲和力高于188Re-GX1和188Re-URP;MTT分析和流式细胞术结果证实188Re-PEG-(GX1)2在体外可有效抑制Co-HUVECs增殖、诱导Co-HUVECs凋亡,作用效果优于188Re-GX1和188Re-URP;2)SPECT成像结果证实188Re-PEG-(GX1)2在荷瘤裸鼠体内具有良好的胃癌靶向性,T/H比值高于188Re-GX1;BLI监测荷瘤裸鼠治疗过程中的肿瘤变化,结果发现188Re-PEG-(GX1)2在体内具有抑制肿瘤增殖的效果,且效果优于188Re-GX1;3)对离体肿瘤组织的CD 31、Ki 67、TUNEL染色,结果表明与188Re-GX1相比,188Re-PEG-(GX1)2在体内更能抑制肿瘤血管新生、抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡;HE染色及生化分析结果表明探针在体内未对肝肾形态及功能造成可见的影响;4)成功制备了68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2,标记率大于97%,在血清中90 min稳定存在;体外细胞受体结合分析及竞争性抑制实验结果表明,68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2与Co-HUVECs的结合高于HUVEC、BGC 823和GES等细胞,说明该探针特异性地与肿瘤血管内皮细胞结合;同时该实验结果也表明68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2与Co-HUVECs的结合高于68Ga-DOTA-GX1,说明二聚体确实提高了GX1的亲和力;细胞免疫荧光证实,KEK-(GX1)2与Co-HUVECs的结合明显高于单体GX1;细胞的摄取和外排实验证明,Co-HUVECs摄取68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2高于68Ga-DOTA-GX1,并且在60 min时达到最大;5)Nano PET/CT成像结果显示,注射68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2的裸鼠肿瘤显像清晰,肿瘤部位的SUV值明显高于注射68Ga-DOTA-GX1的裸鼠,说明探针的体内靶向性较好;最后我们用生物学分布定量地观察探针在荷瘤裸鼠体内的分布,结果显示当肾脏和肝脏等器官快速代谢的时候,注射68Ga-DOTA-GX1的裸鼠肿瘤部位放射性有相对缓慢的下降;同时,在60 min时除了肝肾以外,肿瘤部位的%ID/g超过其他正常器官,结果说明肿瘤对探针有较好的吸收。结论:1)对GX1的修饰成功,GX1二聚体的体内外属性明显优于单体;2)成功制备了既能用于胃癌诊断也能用于胃癌治疗的诊疗一体化探针188Re-PEG-(GX1)2,具有胃癌诊疗的应用前景;3)成功制备了胃癌的PET成像探针68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2,为胃癌PET诊断提供了一个候选探针;4)成功应用了188Re和68Ga两个新型核素,为二者的临床应用提供基础性数据。
【关键词】：GX1 分子影像 血管生成 肿瘤靶向
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 缩略语表6-10
• 中文摘要10-13
• ABSTRACT13-17
• 前言17-19
• 文献回顾19-36
• 第一部分 ~(188)RE-PEG-(GX1)_2 的制备及用于胃癌的SPECT成像和治疗研究36-74
• 引言36-37
• 1 材料37-40
• 1.1 试剂和耗材37-39
• 1.2 仪器设备39-40
• 1.3 细胞株、脐带和实验动物40
• 2 方法40-52
• 2.1 细胞的培养、冻存及复苏40-42
• 2.2 HUVECs的分离培养及鉴定42-43
• 2.3 Co-HUVECs细胞模型的建立43-44
• 2.4 胃癌裸鼠皮下模型的建立44
• 2.5 探针的制备及鉴定44-45
• 2.6 体外细胞结合实验及竞争性抑制分析45-47
• 2.7 荷瘤裸鼠的SPECT成像47
• 2.8 MTT分析观察探针对细胞增殖的影响47-48
• 2.9 流式细胞术观察探针对细胞凋亡的影响48
• 2.10 BLI观察药物在体对荷瘤裸鼠的治疗作用48-49
• 2.11 离体肿瘤组织的切片染色49-51
• 2.11.1 CD31染色判断肿瘤MVD49-50
• 2.11.2 Ki67染色判断肿瘤增殖情况50-51
• 2.11.3 TUNEL分析判断肿瘤细胞凋亡情况51
• 2.12 药物副作用的观察51-52
• 3 结果52-68
• 3.1 HUVECs的鉴定52-53
• 3.2 探针的制备及鉴定53-56
• 3.3 体外细胞结合实验及竞争性抑制分析56-57
• 3.4 ~(188)Re-PEG-(GX1)_2 具有更强的体内靶向性57-58
• 3.5 ~(188)Re-PEG-(GX1)_2 可明显抑制Co-HUVECs的增殖58-59
• 3.6 ~(188)Re-PEG-(GX1)_2 可诱导Co-HUVECs的凋亡59-60
• 3.7 ~(188)Re-PEG-(GX1)_2 体内可抑制肿瘤的生长60-62
• 3.8 离体肿瘤组织的切片染色62-66
• 3.8.1 CD31染色计数肿瘤MVD62-64
• 3.8.2 Ki67染色观察肿瘤增殖情况64
• 3.8.3 TUNEL分析观察肿瘤凋亡情况64-66
• 3.9 药物对正常器官毒副作用的观察66-68
• 3.9.1 生化分析判断药物对肝肾功能的影响66
• 3.9.2 HE染色观察有无脏器的损伤66-68
• 4 讨论68-74
• 第二部分 ~(68)GA-DOTA-KEK-(GX1)_2 的制备及用于胃癌的PET成像研究74-98
• 引言74
• 1 材料74-78
• 1.1 试剂和耗材74-76
• 1.2 仪器设备76-77
• 1.3 细胞株、脐带和实验动物77-78
• 2 方法78-85
• 2.1 细胞的培养、冻存及复苏78-79
• 2.2 HUVECs的分离培养及鉴定79
• 2.3 Co-HUVECs细胞模型的建立79
• 2.4 胃癌裸鼠皮下模型的建立79-80
• 2.5 探针的制备及鉴定80-81
• 2.6 细胞免疫荧光81-82
• 2.7 体外细胞结合实验及竞争性抑制分析82-83
• 2.8 细胞摄取与外排实验83-85
• 2.9 荷瘤裸鼠的Nano PET/CT成像85
• 2.10 生物学分布85
• 3 结果85-95
• 3.1 HUVECs的鉴定86
• 3.2 探针的制备及鉴定86-89
• 3.3 细胞免疫荧光89
• 3.4 体外细胞结合实验及竞争性抑制分析89-91
• 3.5 细胞摄取及外排实验91-93
• 3.6 ~(68)Ga-DOTA-KEK-(GX1)_2 在体具有良好的胃癌靶向性93
• 3.7 生物学分布93-95
• 4 讨论95-98
• 小结98-99
• 参考文献99-126
• 附录126-143
• 个人简历和研究成果143-145
• 致谢145-146

  本文关键词：肿瘤血管靶向肽GX1用于胃癌的分子影像研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：321791