肠上皮细胞Syndecan-1在维持肠粘膜屏障中的作用及机制

发布时间：2017-04-24 17:40

  本文关键词：肠上皮细胞Syndecan-1在维持肠粘膜屏障中的作用及机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的肠粘膜屏障是机体屏障系统的重要组成部分,多种因素可以引起肠粘膜屏障功能受损,导致肠壁通透性增加,细胞旁细胞转运被易化,进一步诱发细菌易位、内毒素血症甚至是全身性炎症反应综合征和多脏器功能衰竭综合征。正常的肠粘膜屏障功能由肠粘膜上皮屏障(或称为机械屏障)、免疫屏障、微生物屏障、化学屏障等组成,其中肠粘膜上皮屏障和免疫屏障被认为是最关键的组成部分。肠上皮屏障由完整的肠上皮细胞、细胞间封闭的紧密连接和粘附连接组成,是肠粘膜物理结构的解剖屏障。封闭的紧密连接是肠上皮细胞之间的主要连接方式,被认为是上皮屏障的结构基础,是维持肠粘膜屏障通透性的决定因素。紧密连接的关键成分包括跨膜蛋白occludin(闭锁蛋白)、claudins(密蛋白)家族等、膜周蛋白zonula occludens(闭锁小带,ZO),以及调节蛋白如激酶、磷酸化酶等多种蛋白。ZO-1 (zonula occludens-1)被认为是紧密连接的支架蛋白,具有PDZ样结合位点(PSD-95、Discs large、Zona ocludens 1)、Src同源SH3结构域(Src homology 3)和GUK鸟苷酸激酶样(Guanylate kinase-like)结一构域等结构,能够连接occludin、claudins蛋白和细胞骨架肌动蛋白及肌球蛋白,在一系列信号分子的调控下,构成稳定的连接系统,封闭细胞之间的间隙。正常情况下,紧密连接在相邻上皮细胞间维持着正常的结构组装和功能状态,只允许离子及小分子可溶性物质通过,而不允许毒性大分子和细菌等微生物通过,从而维持肠上皮屏障功能的完整。目前已经明确,肠道内的各种细菌、毒素及某些炎症因子可通过不同途径影响紧密连接的完整性和通透性,破坏肠粘膜屏障功能。然而近期有研究提示紧密连接单独表达缺失或功能障碍并不足以破坏屏障而引起腹腔感染、败血症及多脏器功能衰竭等疾病,表明仍然存在其它因素参与肠上皮屏障功能的维护。Syndecan-1(CD138, Sdcl)属于跨膜蛋白聚糖类细胞粘附分子,是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的重要成员。生理情况下多表达于成熟上皮细胞基底层,是细胞质膜、细胞间质的重要组成部分,由胞内段、跨膜的核心蛋白和连接于核心蛋白上的硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate, HS)链及硫酸软骨素(chondroitin sulfate, CS)链组成。它可以与多种配体结合,包括粘附分子、细胞外基质、细胞因子、生长因子、趋化因子和细菌表面的肝素结合蛋白等,以共受体的方式在维持细胞形态、促进组织修复、调节免疫功能、参与宿主防御等诸多病理生理过程中发挥重要作用。研究发现Sdcl为稳固肠上皮屏障所必需,是维持上皮屏障的重要保护机制之一。其HS链及类似物乙酰肝素能够抑制多种肠道菌种对肠上皮细胞的粘附,进而抑制细菌被内吞入细胞、发生易位甚至引起系统性感染。Sdcl还能够抑制葡萄球菌肠毒素感染性休克时细胞因子的级联反应和T细胞介导的炎性损伤,保护宿主抵抗全身败血症的发生。Sdcl与紧密连接蛋白均为上皮屏障功能的保护因素,但二者之间是否存在相互作用,是否能够共同参与维持肠上皮屏障的过程现在并不十分明确。我们推测：Sdc1和紧密连接蛋白均参与肠上皮屏障功能的维护,二者可能具有协同作用,共同稳固细胞旁屏障,保持细胞旁路物质转运的选择性。为了证明这一假设,本研究通过利用体外Transwell小室培养法模拟的单层肠上皮模型和体内硫酸葡聚糖钠(Dextran sodium sulfate, DSS)诱导构建的肠上皮屏障缺陷小鼠模型,探讨了Sdc1与紧密连接蛋白的相互作用在肠上皮屏障功能维护中的作用；并进一步揭示了转录因子Stat3在这一过程中的介导作用。研究方法和结果1.筛选Sdcl不同表达水平的肠上皮细胞,构建单层肠上皮屏障障模型采用荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光法检测四种经文献报道,具有形成融合性单层上皮潜能的结肠癌上皮细胞株(HT29、LoVo、SW480、Caco-2)细胞中的Sdcl的表达水平,结果提示Sdcl在HT29细胞中为显著高表达(F=103.111,P0.001),并且大多集中于细胞膜上,而Caco-2细胞中的Sdcl表达水平最低。因此选取这两种细胞用于构建单层肠上皮屏障模型,采用跨膜电阻仪检测上皮跨膜电阻(transepithelial electrical resistance, TEER)来评价上皮屏障的完整性,在大肠杆菌刺激后检测细菌易位,通过荧光素FITC-dextran (FD4)的旁细胞转运评价上皮屏障的通透性。结果显示：在Transwell小室底部内侧培养细胞15d之后,TEER值显著升高,约为300 ohms cm2,证明单层肠上皮屏障形成。大肠杆菌刺激后,以处理前TEER值为对照,TEER实测值的绝对值及其与处理前TEER值的比值均呈现时间依赖性的减少,而在未被细菌处理的上皮屏障中TEER值基本维持稳定。在Caco-2细胞构建的单层上皮屏障中,TEER值减少更加显著(F=49.030,P0.001),大肠杆菌的易位量(t=8.373,P=0.001)和FD4的透过量(t=9.689,P=0.001)也均较HT29细胞更加显著。为了明确上述屏障功能改变是否依赖于紧密连接蛋白的变化,在细菌刺激过程同时检测肠上皮细胞是否会因细胞毒性反应发生细胞膜损伤、细胞凋亡,以及是否发生紧密连接结构的重组。结果显示：大肠杆菌刺激细胞5h后,与未处理细胞比较,LDH释放、caspase-3激活均并不显著,而分别以Triton X-100 (HT29细胞：t=9.362,P=0.001; Caco-2细胞：t=12.566,P0.001)及环孢菌素A(Cyclosporin A, CsA)为阳性对照的处理组均表现出显著的细胞损伤。正常细胞未受到细菌刺激时,免疫荧光染色可见ZO-1呈典型的线性荧光,沿细胞膜分布；大肠杆菌刺激细胞5h后,ZO-1荧光信号减弱,并且分布丢失明显的规律性。上述结果说明在采用Transwell小室构建单层上皮屏障模型的过程中,利用细菌刺激细胞5 h,细胞毒性反应并不显著,所发生的屏障功能的改变可能与紧密连接改变有关,而与细胞凋亡或坏死的关系不显著。2.Sdc1能缓解大肠杆菌刺激后的屏障功能受损及细菌易位利用慢病毒载体将外源性的Sdc1导入Caco-2细胞,经过2周左右2 μg/mL puromycin筛选,建立了Sdc1表达显著升高的细胞克隆,通过荧光定量PCR和Western blot对细胞克隆进行鉴定,结果显示Sdcl在mRNA (t=14.381, P0.001)和蛋白水平均显著增加。利用Lipofectmine 2000瞬时转染Sdcl siRNA进入HT29细胞,转染48 h后,Sdc1在mRNA (t=56.292, P0.001)和蛋白的表达水平均显著降低。分别利用经过上述处理的细胞构建单层上皮屏障模型,检测屏障功能变化。结果显示,对Caco-2细胞上调Sdc1表达后,TEER值减低率(F=39.841,P0.001)、大肠杆菌易位(F=73.726,P0.001)、FD4透过值(F=54.835,P0.001)均显著升高。与之相反,HT29细胞下调Sdc1表达后,TEER值减低率(F=34.098,P0.001)、大肠杆菌易位(F=33.782,P=0.001)、FD4透过值(F=153.383,P0.001)均显著升高。以上结果提示Sdc1对上皮屏障功能可能具有保护作用。3.Sdc1能缓解金黄色葡萄球菌刺激后的屏障功能受损及细菌易位利用金黄色葡萄球菌刺激上述已经构建好的单层上皮屏障,结果显示,刺激5h后,与对照组相比,高表达Sdc1的Caco-2细胞的TEER值减低率(F=129.269,P0.001)和葡萄球菌易位(F=39.479,P0.001)均显著减少：而敲低Sdc1表达的HT29细胞中,TEER值减低率(F=124.132,P0.001)和葡萄球菌易位(F=51.965,P=0.001)均显著增加,均与大肠杆菌刺激屏障后的结果一致。以上结果提示Sdc1对上皮屏障功能的保护作用并非呈刺激细菌依赖性,而可能是一种对各种细菌-上皮作用普遍存在的现象。4.Sdc1能够减轻紧密连接蛋白缺陷细胞的屏障功能受损HT29细胞单独转染ZO-1 siRNA后,ZO-1蛋白表达水平显著下降,若在此基础上同时给予Sdcl慢病毒载体处理使Sdc1表达水平升高,就能够显著减弱ZO-1蛋白的下降程度。在上述ZO-1蛋白缺陷的细胞中检测Sdc1表达改变前后屏障功能的变化,结果显示：在HT29细胞单独转染ZO-1 siRNA下调ZO-1蛋白表达水平后,与对照组相比,单层上皮屏障的TEER值减低率(F=138.489,P0.001)、大肠杆菌易位(t=11.624, P0.001)、FD4透过值(t=14.802,P0.001)均显著升高。若同时给予Sdcl慢病毒载体处理使ZO-1沉默作用被减轻,上述指标升高的程度均有所减少,提示受损的屏障功能被部分恢复,Sdc1可能对ZO-1蛋白缺陷的细胞具有保护作用。但与单独感染Sdc1慢病毒载体上调Sdc1表达水平,而对ZO-1蛋白不作专门处理的细胞相比,上述指标仍然有所下降,单层上皮屏障的功能仍然较低。HT29细胞单独给予occludin siRNA或同时给予occludin siRNA和Sdcl慢病毒载体联合处理后,结果表现出同样的趋势。以上结果提示Sdcl对于ZO-1或occludin蛋白缺陷细胞的屏障功能同样具有保护作用,并且能够减轻由于紧密连接损失导致的屏障功能受损。5.Sdc1能够缓解小鼠体内DSS诱导的屏障缺陷及细菌易位利用DSS诱导结肠炎的方法构建肠粘膜屏障缺陷小鼠模型,通过尾静脉注射Sdc1高表达质粒的方法进行体内转染,上调Sdc1表达,之后评估肠粘膜紧密连接蛋白表达及超微结构、组织细菌易位、肠粘膜组织病理学变化等相应屏障功能的改变。结果发现：PBS对照组小鼠一般情况及大便性状均无显著变化,DAI评分为0；组织病理学检查和紧密连接超微结构亦无显著改变。小鼠饮用DSS溶液3-5天后逐渐出现腹泻、不同程度的稀便至血便等症状,DAI评分升高(F=559.328,P0.001),结肠缩短。肉眼观察结肠组织,可见结肠缩短,受累肠段变紫红至黑褐色,肠壁充血、水肿,与周围组织粘连,部分可见糜烂及溃疡。组织病理学可见肠粘膜不完整,可见多灶性浅溃疡,杯状细胞减少,隐窝及腺体正常结构消失,部分病灶表面仅残留少许上皮或上皮结构已被完全破坏,粘膜层及粘膜下层大量炎性细胞浸润。电镜观察可见紧密连接结构减少、间隙增宽。提取肠粘膜蛋白进行Western blot检测,发现Sdcl及ZO-1、occludin蛋白的表达水平均减少。与DSS对照组相比,对小鼠进行尾静脉注射Sdc1表达质粒上调Sdc1表达后,小鼠结肠病变有所减轻,疾病活动度和结肠炎症程度减低(DAI评分：F=559.328,P0.001),结肠缩短和体重下降程度亦不及对照组显著；肉眼观察可见肠管充血、水肿,但糜烂和溃疡较少,病理组织学检查可见有少量上皮细胞和腺体细胞再生并移行；电镜观察可见紧密连接结构较完整,细胞间隙扩大程度有所减低；ZO-1、occludin蛋白的表达水平也有所增加。说明Sdcl在体内对肠粘膜上皮屏障同样具有保护作用。并且在DSS诱导前通过尾静脉注射Sdcl进行预处理产生的效果较DSS诱导后注射Sdcl进行处理的效果更显著(DAI评分：F=559.328,P0.001),提示Sdc1可能具有预防肠粘膜屏障缺陷产生的作用。而尾静脉注射pcDNA3.0空白对照质粒后小鼠结肠炎症症状与DSS对照组相比差别并不显著。提取不同处理组小鼠肠系膜淋巴结、肝、脾组织样本的基因组DNA进行荧光定量PCR检测,计算其中的细菌含量。PBS对照组小鼠的肠系膜淋巴结、肝、脾组织无细菌易位发生。与PBS对照组相比,单纯DSS处理组小鼠肠系膜淋巴结、肝、脾样本中的细菌16S rDNA含量升高,菌群检测为阳性,发生细菌易位。并且在DSS处理组内,从肠系膜淋巴结、肝、脾中检测到的细菌含量呈现逐渐减少的趋势(P0.05)。在肠系膜淋巴结检测到的细菌中,以肠球菌属、双歧杆菌属、拟杆菌属为主,其次分别为梭菌属和肠杆菌属。在肝脏检测到的细菌中,肠杆菌属、拟杆菌属和梭菌属较多,其次为肠球菌属和双歧杆菌属。在脾脏检测到的是肠球菌属和肠杆菌属。在三种组织中,均未检测到乳酸杆菌属的细菌。尾静脉注射Sdcl质粒上调Sdcl表达水平后,三种组织中的菌群总数和各亚属的数量均呈现减少的趋势(P0.05),尤其以脾脏最为显著,在脾脏中均未检测到任何细菌。以上结果提示Sdcl能够抑制体内屏障缺陷模型的细菌易位。6.Sdcl与紧密连接蛋白ZO-1、occludin在细胞中的表达及分布相似利用免疫荧光染色从细胞水平观察Sdc1与ZO-1、occludin的细胞内定位,结果发现Sdcl和ZO-1、occludin分布位置相似,均以细胞膜上分布为主。Caco-2细胞上调Sdcl表达后,Western blot检测结果提示ZO-1和occludin的表达水平均升高；HT29细胞敲除Sdc1表达后,ZO-1和occludin的表达水平也均有一定程度的降低。7.Sdcl通过激活Stat3信号通路调控ZO-1和occludin的表达在高表达Sdcl的细胞中,Stat3发生705位酪氨酸磷酸化修饰,提示Stat3信号通路被激活。利用IL-6刺激HT29细胞诱导Stat3通路被激活,或通过带有Stat3持续活化型质粒的慢病毒载体感染细胞诱导Stat3通路的持续活化后,ZO-1(F=5471.716,P0.001)和occludin (F=151.487, P0.001)的表达均显著增高,mRNA和蛋白水平的变化保持一致,并且与Sdcl高表达细胞中ZO-1和occludin的改变一致。通过感染带有Stat3显性负性突变型质粒的慢病毒载体阻断Stat3的转录活性后,细胞中ZO-1和occludin的表达水平均减少(P0.001)。如果在阻断Stat3转录活性同时再感染Sdc1慢病毒载体上调Sdcl表达,Sdc1对ZO-1和occludin的表达调控作用就被削弱,提示Sdcl是通过Stat3通路的介导从而发挥对ZO-1和occludin的调控作用的。8. Stat3信号通路参与Sdcl对肠上皮屏障功能的维护在细胞中阻断Stat3转录活性的同时上调Sdcl的表达水平,检测Sdcl表达水平改变前后肠上皮单层屏障模型的功能变化。结果提示：单独阻断Stat3的转录活性,单层上皮屏障功能受损,表现为TEER值下降(F=83.270,P0.001),大肠杆菌易位(t=3.954,P=0.017)及FD4透过增加(t=11.143,P0.001)。尽管Sdcl能够维持细胞的TEER值在较高水平,抑制细菌易位和FD4的跨膜转运,但当Stat3通路被阻断时,Sdcl的上述保护作用就被削弱。9. Stat3能直接结合ZO-1和occludin的启动子生物信息学预测发现：在人类ZO-1和occludin基因及其转录起始位点上游约10 kb以内的DNA序列中,可以找到多个类似Stat3结合核心序列(TTCCGGAA)的DNA序列,被认为是潜在的Stat3的DNA结合位点,随后利用ChIP实验验证其是否位于ZO-1或occludin的启动子区域。结果提示：在ZO-1转录起始位点上游-199～-208 bp、-394--404 bp处,occludin转录起始位点上游-4458■4469 bp、-5385-5394 bp、-7056-7066 bp处分别找到若干个与Stat3分子DNA结合序列最相似的序列,ChIP-PCR显示ZO-1和occludin基因的启动子序列通过Stat3-ChIP得到了富集(P0.05),证明Stat3可以与ZO-1和occludin的启动子结合。当Caco-2细胞高表达Sdcl时,Stat3向ZO-1和occludin启动子区域的募集显著增加(P0.01)。在HT29细胞中敲除Sdcl后,Stat3的募集相对减少(P0.01)。这些结果表明,Sdc1能够激活Stat3分子发生磷酸化,Stat3能够直接靶向结合ZO-1和occludin的启动子,三者表达水平呈正相关。对结果5所述的动物实验中的肠粘膜蛋白进行Western blot检测,发现尾静脉注射Sdc1表达质粒组小鼠的肠粘膜中Sdc1及ZO-1、occludin蛋白表达水平增加的同时,Stat3信号通路也被激活,Stat3分子被显著磷酸化,体内、外结果保持一致。10. ZO-1与occludin具有相互作用,反馈调节Sdc1表达Co-IP实验提示免疫沉淀的ZO-1复合体中可以检测到occludin蛋白的存在,同样,在免疫沉淀的occludin复合体中也可以检测到ZO-1蛋白的存在；而ZO-1和occludin与作为阴性对照的IgG蛋白不发生任何结合作用,表明ZO-1和occludin二者能够发生相互作用,构成免疫复合体。在HT29细胞中,敲除ZO-1或occludin蛋白,Sdc1的表达水平呈反馈性增加。提示三者可能构成负反馈环路,共同参与对肠上皮屏障功能的维持。结论1、Sdc1对肠上皮屏障的维护具有保护作用,表现为能够显著稳定上皮的完整性、抑制细菌易位和降低跨膜转运的通透性；2、Sdcl能够在体外提高紧密连接蛋白缺陷细胞的单层上皮屏障功能；3、Sdcl能够在体内缓解DSS诱导的屏障缺陷及细菌易位；4、Sdcl与紧密连接蛋白ZO-1、occludin在细胞中的表达同步、分布相似；5、Sdcl能够激活Stat3信号通路,磷酸化的Stat3直接结合ZO-1和occludin的启动子区域,调控ZO-1和occludin的转录,从而参与Sdc1对屏障功能的维护；6、ZO-1与occludin具有相互作用,构成免疫复合体,能负反馈调节Sdc1表达,共同构成环路维护屏障功能保持正常。
【关键词】：肠粘膜屏障 紧密连接 Syndecan-1 Stat3信号通路 细菌易位
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R574
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-20
• 第一部分 Syndecan-1与紧密连接蛋白ZO-1、occludin在维护肠上皮屏障中的作用20-70
• 1. 前言20-24
• 2. 实验材料24-27
• 3 实验仪器27-28
• 4 实验方法28-40
• 5 结果40-67
• 6 讨论67-70
• 第二部分 Syndecan-1通过激活Stat3通路调控紧密连接蛋白ZO-1、occludin的表达和功能70-94
• 1 前言70-71
• 2 实验材料71-75
• 3 实验方法75-79
• 4 结果79-91
• 5 讨论91-94
• 全文小结94-95
• 参考文献95-102
• 中英文缩略词对照表102-104
• 综述104-113
• 参考文献110-113
• 攻读学位期间发表的论文113-114
• 致谢114-117
• 统计学证明117

  本文关键词：肠上皮细胞Syndecan-1在维持肠粘膜屏障中的作用及机制，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：324652