结核分枝杆菌临床分离株乙胺丁醇耐药分析及其耐药相关基因的研究

发布时间：2017-04-27 04:04

  本文关键词：结核分枝杆菌临床分离株乙胺丁醇耐药分析及其耐药相关基因的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:结核分枝杆菌对乙胺丁醇产生耐药的临床特点以及耐药相关分子机制比较复杂,需要进一步研究,尤其是与耐药相关的基因突变也有待进一步发现。为此,本研究通过分析乙胺丁醇耐药的特点和产生的危险因素、耐药相关基因的突变方式以及突变可能引起的蛋白质功能变化、非编码区突变造成的二级结构改变等几个方面来更加全面的阐述结核分枝杆菌对乙胺丁醇产生耐药的机制。方法:1.临床回顾性分析研究选取了2129株临床结核分枝杆菌及其相应的结核病病例。人口学资料和菌株耐药性分析分为乙胺丁醇耐药组和敏感组,并分别比较两组的差异。乙胺丁醇耐药危险因素主要分析了不规则用药、药物副反应、原发耐药;与异烟肼和利福平耐药进行比较,重点比较了用药次数、用药时间和治疗方案这三个方面的不规则用药。2.耐药相关基因突变研究:选择了Rv0179c,Rv0026,Rv1058,Rv1699,Rv2807,Rv2947c,Rv3756c,Rv3877,Rv1080c-Rv1081c,Rv1482c-Rv1483,Rv2416c-Rv2417c,Rv3796-Rv3797,Rv2427c-Rv2428,Rv2733-Rv2734,Rv2754c-Rv2755c,Rv3428c-Rv3429,Rv3793-Rv3794,Rv3901c-Rv3902c,Rv3806,emb B,emb A,emb C和emb R,共23个基因。研究选取了183株EMB耐药菌株。提取183株EMB耐药结核分枝杆菌的DNA,分别用PCR方法扩增获取相应片段,并对这些片段分别测序两次,测序结果与H37Rv(ATCC 27294)比对,找到相关的突变位点,并查找氨基酸的变化形式。运用Predict SNP软件预测氨基酸的突变对蛋白质结构和功能的影响。通过H37Rv(ATCC 27294)密码子偏好库查找了同义突变密码子的偏好性变化。运用Gene Quest分析碱基突变前后非编码RNA结构的变化。结果:1.2129株临床菌株中,有228株对乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)耐药,耐药比例为10.71%;其中1130株是全敏感菌株,比例为53.08%。在228株EMB耐药菌株中,初治病例为181例(79.4%),复治为47例(20.6%);异烟肼(isoniazid,INH)耐药164株(71.9%),利福平(Rifampicin,RFP)耐药171株(75%),耐多药结核病(multi-drug resistant tuberculosis,MDR-TB)134株(58.8%)。比较EMB耐药组和EMB敏感组发现两者仅在初复治的比例方面存在显著差异(P=0.01),EMB耐药组中复治结核病人的比例高;而在病人年龄、性别、吸烟历史以及结核病合并其他疾病方面差异都不显著(P0.05)。在EMB耐药菌的耐药谱方面:EMB耐药组平均对2种以上的抗结核药物耐药(2.19±0.10),EMB敏感组平均对0.79±0.04种药耐药,两组差异显著(P0.001)。EMB耐药组中的MDR-TB所占的比例(58.8%)高于EMB敏感组(17.0%),二者差异极显著(P0.001),这提示高比例的MDR-TB是EMB耐药组耐药谱广的主要原因。在EMB耐药性产生的危险因素方面:EMB耐药的主要危险因素是不规则治疗(47.25%),药物副反应(4.40%)和原发性耐药(48.35%)。从不规则治疗的次数来看,在耐药性产生之前EMB被使用过2.86±0.69次,较INH(1.67±0.88次)和RFP(1.39±0.61次)高,说明EMB反复使用较多次数之后才产生耐药性。从不规则药物治疗时间(少于6个月)来看,EMB产生耐药所需时间为5.0±0.94月,较INH(3.78±1.28月)和RFP(3.89±0.60月)时间长。而不规则药物治疗(6个月以上)中,EMB、INH和RFP三者产生耐药性所需的时间没有差异。2.在所有研究的基因中,Rv0026,Rv1058,Rv1699,Rv2807,Rv3756,Rv2416c-6Rv2417c,Rv3796-Rv3797,Rv2733-Rv2734,Rv2754c-Rv2755c和Rv3428c-Rv3429的碱基突变率分别为2.5%、1.25%、1.25%、2.5%、0、0、0、0、2.5%和1.25%,突变率很低,而且没有任何重复性。Rv0179c,Rv2947c和Rv3877突变较多。Rv0179c共有18个位点发生了碱基突变,分别是S102*、A198G、S214L、L215P、D236E、F254L、V62A、G164A、S166I、W167C、S169T、T170T、N182T、H183R、Q186R、K202E、G204A和Y227F,共有46株菌突变,占所分析160株EMB耐药菌株的28.75%。Rv2947c有D213G和P448S突变,共8株菌突变,占167株EMB耐药菌的4.79%。Rv3877有11个位点发生了碱基突变,分别是P39S、E45D、G370G、I439I、L454L、L88L、C203*、Q281H、I289T、A354A和S466S,总共突变16株菌,占所分析168株EMB耐药菌株的9.52%。基因芯片的生物信息学分析表明:在EMB刺激下,上述突变频率较高的三个基因的表达水平都显著增高;而那些突变频率很低的基因的表达水平则不受EMB刺激的影响。emb R、emb A、emb C、emb B、Rv3806基因的突变率分别是3.3%、3.8%、4.1%、74.17%、8.46%,其中emb R、emb A、emb C、Rv3806的突变菌株大多同时存在emb B基因突变。emb B基因有6个位点的突变,分别是emb B306、emb B328、emb B354、emb B406、emb B439、emb B497、emb B531,突变率分别为54.6%、1.8%、3.7%、31.7%、8.3%、5%。emb B306有6种碱基突变形式,3种氨基酸突变形式,分别是M306VM306IM306L,突变率为54.6%。emb B406有31.7%突变率,而且emb B406倾向于不与emb B306同时发生突变。通过预测以下氨基酸突变对蛋白质的结构和功能会有不良影响:emb R基因的P243S,emb A基因的L105V、R380P突变,emb B基因的M306L、D328H、G406D、Q497K、Q497R;Rv0179c基因的S166I、W167C、K202E、L215P、D236E、F254L突变;Rv2947c的D213G突变;Rv3877基因的P39S和I289T的突变。其余突变形式对蛋白质的结构和功能的影响为中性。有5个非编码区发生了较多且有重复性的突变,它们分别是Rv1080 cRv1081c(Rv1080c-Rv1081c)、Rv1482c-Rv1483、IG1872(Rv2427c-2428)、IG2934(Rv3793-Rv3794)和IG3021(Rv3901c-Rv3902c)。这些位点的突变会引起非编码RNA二级结构的改变。结论:1.EMB耐药在结核病临床中较为常见,其中原发性EMB耐药较多,其发生与病人年龄、性别、吸烟历史以及结核病合并其他疾病无显著关系。2.EMB耐药菌具有较广的耐药谱,其中MDR-TB菌占多数。3.临床中EMB和INH、RFP相比不容易产生耐药,表现在它在产生耐药前持续用药时间长且多次反复使用。4.研究的23个基因中,emb基因是EMB耐药中突变率最高的基因,其中又以emb B306密码子和emb B406密码子的突变率最高,且emb B406倾向于不与emb B306密码子同时发生突变(P=0.037)。5.实验筛选到Rv0179c、Rv2947c和Rv3877三个新基因在EMB耐药菌中存在较高的突变率。6.实验筛选到Rv1080c-Rv1081c、Rv1482c-Rv1483、IG1872(Rv2427c-Rv2428)、IG2934(Rv3793-Rv3794)、IG2991(Rv3862c-Rv3863)、IG3021(Rv3901c-Rv3902c),共5个非编码区在EMB耐药菌中存在较高的突变率,突变会造成非编码RNA二级结构的改变。7.突变有非同义突变(氨基酸突变)和同义突变。部分氨基酸突变较大地影响了蛋白结构和功能;同义突变使密码子的偏好性降低,从而对蛋白的合成造成影响,进而影响了耐药表型。
【关键词】：结核分枝杆菌 乙胺丁醇 耐药 治疗 危险因素 突变 基因 分子机制
【学位授予单位】：北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.5;R52
【目录】：

• 英文缩略词9-12
• 摘要12-16
• Abstract16-21
• 前言21-24
• 参考文献22-24
• 第一章 EMB耐药结核病的临床回顾性分析24-43
• 材料和方法24-29
• 1.材料24-26
• 1.1 研究对象24
• 1.2 试验试剂和仪器24-26
• 1.2.1 试验仪器24
• 1.2.2 主要试剂及配制24-26
• 2.方法26-29
• 2.1 临床分析26-27
• 2.1.1 EMB耐药人.学特点26
• 2.1.2 EMB耐药菌株耐药谱26-27
• 2.1.3 EMB耐药危险因素的分析27
• 2.2 药敏试验的绝对浓度法27-29
• 2.2.1 药物浓度27-28
• 2.2.2 结核分枝杆菌复苏28
• 2.2.3 结核分枝杆菌的培养28
• 2.2.4 菌液接种28-29
• 2.2.5 判定标准29
• 3．统计方法29
• 结果29-36
• 1.菌株的一般耐药特点29-30
• 2.EMB耐药病人的人.学特点30
• 3. EMB耐药的药物谱30-33
• 4. 常见耐药风险因素在EMB上的体现33-34
• 5. 不规则治疗在INH、RFP和EMB药物上的具体体现34-36
• 5.1 耐药性产生前的用药次数比较34
• 5.2 耐药性产生前的治疗时间比较34-36
• 讨论36-39
• 1．EMB耐药结核病的耐药率36-37
• 2．常见耐药性危险因素在EMB药物上的体现37-38
• 3．EMB耐药性与耐药谱的关系38
• 4．EMB耐药与INH/RFP耐药的联系38-39
• 结论39-40
• 参考文献40-43
• 第二章 EMB耐药相关基因突变研究43-91
• 材料和方法43-56
• 1. 试验材料43-47
• 1.1 研究对象43-45
• 1.1.1 EMB耐药结核分枝杆菌43-44
• 1.1.2 待研究基因44-45
• 1.2 试验试剂和仪器45-47
• 1.2.1 试验试剂45-46
• 1.2.2 试验仪器46-47
• 2. 试验方法47-56
• 2.1 DNA提取47-48
• 2.2 目的片段扩增48-49
• 2.2.1 引物合成48
• 2.2.2 PCR48-49
• 2.2.3 电泳49
• 2.3 DNA测序49-52
• 2.4 基因突变分析52-54
• 2.4.1 突变位点分析52-53
• 2.4.2 SNP非同义突变危害程度53
• 2.4.3 同义突变密码子偏好性53-54
• 2.5 分析方法54-56
• 结果56-76
• 1. 各基因扩增片段结果56-57
• 2. 突变很少的基因57-58
• 3. embB、embA、embC、embR、Rv3806c58-64
• 3.1 embB58-59
• 3.2 embA59
• 3.3 embC59-60
• 3.4 embR60
• 3.5 Rv3806c60-62
• 3.6 不同突变对蛋白功能和表达的影响62-64
• 4. 突变频率较大的新基因64-67
• 4.1 Rv0179c65
• 4.2 Rv2947c65
• 4.3 Rv387765-67
• 5.同义突变67
• 6. EMB刺激下的芯片数据再分析67-68
• 7．多种位点、基因突变联合检测耐药68-69
• 8. 非编码区69-76
• 8.1 非编码区的碱基突变69-74
• 8.2 非编码区碱基突变引起的非编码RNA结构改变74-76
• 讨论76-84
• 1. EMB耐药的机制76-79
• 1.1 编码基因的突变形式和频率76-78
• 1.2 EMB耐药性突变在耐药性检测中的应用78-79
• 2.三个突变频率较高的基因的功能79-80
• 2.1 Rv0179c79
• 2.2 Rv2947c79
• 2.3 Rv387779-80
• 3.耐药相关基因突变：非同义突变和同义突变各自的生物学意义80-82
• 4.非编码RNA功能82-84
• 结论84-85
• 参考文献85-91
• 附表 191-101
• 论文综述101-127
• 一、结核分枝杆菌的耐药机制101-110
• 1.结核分枝杆菌细胞壁的物理屏障作用101-102
• 2.细胞膜上药物外排泵的药物泵出菌体作用102-103
• 3.结核分枝杆菌耐药基因突变103-110
• 3.1 利福平104-105
• 3.2 异烟肼105-107
• 3.3 氟喹诺酮107-108
• 3.4 吡嗪酰胺( PZA) 耐药的分子机制108-110
• 二、EMB的耐药机制110-116
• 1．EMB的作用机理110-111
• 2.EMB分子耐药机制111-116
• 2.1 与EMB有关的药物外排泵111-112
• 2.2 与EMB有关的耐药基因突变112-116
• 参考文献116-127
• 攻读博士学位期间发表文章127-129
• 博士期间参与申请的基金129-130
• 致谢130-131
• 个人简历131

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 全国结核病流行病学抽样调查技术指导组;2000年全国结核病流行病学抽样调查报告[J];中国防痨杂志;2002年02期

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本文编号：329847