SIRT1亚细胞定位对卵巢癌细胞顺铂敏感性和迁移侵袭的影响
发布时间：2021-08-06 02:22
目的:沉默信息调节因子1（Silencing information regulator 1,SIRT1）是影响肿瘤发生和进展的重要调节分子,但关于SIRT1在肿瘤（包括卵巢癌）中发挥促癌作用抑或抑癌作用至今仍存在争议。早在十几年前,就有文献报道SIRT1存在核-质穿梭过程,但对于SIRT1的亚细胞定位在卵巢癌中的作用目前仍知之甚少。本研究的目的是探讨SIRT1亚细胞定位对卵巢癌细胞顺铂敏感性和迁移侵袭的影响及其相关机制。方法:1.通过构建具有野生型SIRT1、核输出序列（Nuclear Export Sequences,NESs）突变型SIRT1(SIRT1NESmt)和核定位序列（Nuclear Localization Sequences,NLSs）突变型SIRT1(SIRT1NLSmt)编码序列的慢病毒载体,转染人类卵巢癌IGROV1细胞和HEY细胞,通过筛选获得过表达野生型SIRT1、NESs突变型SIRT1和NLSs突变型SIRT1的卵巢癌稳定转染细胞株(以下简称为SIRT1细胞、SIRT1NESmt细胞和S...
【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校
【文章页数】：117 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
荧光显微镜下观察对照组（Con136）中的GFP以及SIRT1细胞、SIRT1NESmt细胞和SIRT1NLSmt细胞中的SIRT1-GFP融合蛋白
空军军医大学博士学位论文-45-图1.2稳定转染细胞中外源性SIRT1表达检测（A、B）显示通过real-timePCR检测IGROV1系列细胞和HEY系列细胞中SIRT1mRNA相对表达水平（n=3；ns，无统计学意义；***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05，均与Con136比较）。（C、D）显示Westernblot对各组细胞中SIRT1水平的检测。SIRT1表示细胞内源性SIRT1，SIRT1-GFP代表外源性SIRT1；Actin用作衡量各组中蛋白上样量的内参蛋白。Figure1.2DetectionofSIRT1expressioninstablytransfectedcellsSIRT1mRNAlevelsmeasuredbyreal-timePCRinIGROV1andHEYcellgroups(parentalcells,Con136,SIRT1,SIRT1NESmtandSIRT1NLSmtcells)wereshownin(A)and(B).Eachbarrepresentedthemean±SD(n=3;ns,notsignificant;***,P<0.001;**,P<0.01;*,P<0.05).ProteinlevelsofendogenousSIRT1andexogenousSIRT1-GFPdeterminedbyWesternblotanalyseswereshownin(C)and(D).Actinwasusedastheloadingcontrol.接下来我们分离提取各组细胞的细胞质、细胞核组分，进行了Westernblot检测，以进一步确定NESs序列和NLSs序列突变是否能够影响外源性SIRT1的表达，影响其亚细胞的分布。从图1.3中Westernblot检测结果可以看出，SIRT1NESmt细胞中SIRT1-GFP的胞
空军军医大学博士学位论文-46-核分布显著增加，符合我们设计之初的预想，即通过突变核输出序列限制SIRT1出核，以达到提高其胞核定位的目的。SIRT1NLSmt细胞中SIRT1-GFP的胞核分布显著减少，绝大多数集中于胞质中，也提示我们通过核定位序列突变，阻碍了SIRT1向核内的运输，从而使其在细胞质中富集。上述结果显示，我们的构建策略有效地影响了SIRT1的核-质穿梭，获得了过表达不同亚细胞定位SIRT1的卵巢癌稳转细胞株。图1.3卵巢癌细胞胞质和胞核组分中内源性SIRT1和外源性SIRT1-GFP的表达情况Tubulin和LaminB分别用作细胞质和细胞核的内参蛋白。Figure1.3SIRT1expressionincytoplasmicandnuclearextractsfromparentalcells,Con136,SIRT1,SIRT1NLSmtandSIRT1NLSmtcellsTubulinandlaminBwereusedasthecytoplasmicandnuclearloadingcontrols,respectively.3.2各组稳定转染细胞SIRT1去乙酰化酶功能的检测及比较由于SIRT1是去乙酰化酶，我们在改变其亚细胞定位的同时应确保其去乙酰化酶的功能不受影响，如果以损害其酶活性为代价改变亚细胞定位，势必会大大减弱我们研究的意义，于是我们设法对各组稳转细胞中SIRT1的去乙酰化酶活性进行了评估。p53是SIRT1去乙酰化作用的已知靶分子，其382位赖氨酸残基（lys382，K382）的乙酰化状态可以被SIRT1解除，因此比较K382位点乙酰化p53（Ac-K382p53）的水平可以相对衡量各组细胞间外源性SIRT1的去乙酰化酶活性。但p53作为促凋亡蛋白，在正常情况下其本底水平较低且半衰期短，当细胞遭遇细胞毒性或DNA损伤事件时，其表达水平和乙酰化水平明显增加，阻断细胞周期，促使细胞进行损伤修复，或者进入细胞死亡的程序。因此，我们对IGROV1的各组稳转细胞给予了顺铂处理，以诱导p53的表达和乙酰化水平的增
本文编号：3324879
【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校
【文章页数】：117 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
荧光显微镜下观察对照组（Con136）中的GFP以及SIRT1细胞、SIRT1NESmt细胞和SIRT1NLSmt细胞中的SIRT1-GFP融合蛋白
空军军医大学博士学位论文-45-图1.2稳定转染细胞中外源性SIRT1表达检测（A、B）显示通过real-timePCR检测IGROV1系列细胞和HEY系列细胞中SIRT1mRNA相对表达水平（n=3；ns，无统计学意义；***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05，均与Con136比较）。（C、D）显示Westernblot对各组细胞中SIRT1水平的检测。SIRT1表示细胞内源性SIRT1，SIRT1-GFP代表外源性SIRT1；Actin用作衡量各组中蛋白上样量的内参蛋白。Figure1.2DetectionofSIRT1expressioninstablytransfectedcellsSIRT1mRNAlevelsmeasuredbyreal-timePCRinIGROV1andHEYcellgroups(parentalcells,Con136,SIRT1,SIRT1NESmtandSIRT1NLSmtcells)wereshownin(A)and(B).Eachbarrepresentedthemean±SD(n=3;ns,notsignificant;***,P<0.001;**,P<0.01;*,P<0.05).ProteinlevelsofendogenousSIRT1andexogenousSIRT1-GFPdeterminedbyWesternblotanalyseswereshownin(C)and(D).Actinwasusedastheloadingcontrol.接下来我们分离提取各组细胞的细胞质、细胞核组分，进行了Westernblot检测，以进一步确定NESs序列和NLSs序列突变是否能够影响外源性SIRT1的表达，影响其亚细胞的分布。从图1.3中Westernblot检测结果可以看出，SIRT1NESmt细胞中SIRT1-GFP的胞
空军军医大学博士学位论文-46-核分布显著增加，符合我们设计之初的预想，即通过突变核输出序列限制SIRT1出核，以达到提高其胞核定位的目的。SIRT1NLSmt细胞中SIRT1-GFP的胞核分布显著减少，绝大多数集中于胞质中，也提示我们通过核定位序列突变，阻碍了SIRT1向核内的运输，从而使其在细胞质中富集。上述结果显示，我们的构建策略有效地影响了SIRT1的核-质穿梭，获得了过表达不同亚细胞定位SIRT1的卵巢癌稳转细胞株。图1.3卵巢癌细胞胞质和胞核组分中内源性SIRT1和外源性SIRT1-GFP的表达情况Tubulin和LaminB分别用作细胞质和细胞核的内参蛋白。Figure1.3SIRT1expressionincytoplasmicandnuclearextractsfromparentalcells,Con136,SIRT1,SIRT1NLSmtandSIRT1NLSmtcellsTubulinandlaminBwereusedasthecytoplasmicandnuclearloadingcontrols,respectively.3.2各组稳定转染细胞SIRT1去乙酰化酶功能的检测及比较由于SIRT1是去乙酰化酶，我们在改变其亚细胞定位的同时应确保其去乙酰化酶的功能不受影响，如果以损害其酶活性为代价改变亚细胞定位，势必会大大减弱我们研究的意义，于是我们设法对各组稳转细胞中SIRT1的去乙酰化酶活性进行了评估。p53是SIRT1去乙酰化作用的已知靶分子，其382位赖氨酸残基（lys382，K382）的乙酰化状态可以被SIRT1解除，因此比较K382位点乙酰化p53（Ac-K382p53）的水平可以相对衡量各组细胞间外源性SIRT1的去乙酰化酶活性。但p53作为促凋亡蛋白，在正常情况下其本底水平较低且半衰期短，当细胞遭遇细胞毒性或DNA损伤事件时，其表达水平和乙酰化水平明显增加，阻断细胞周期，促使细胞进行损伤修复，或者进入细胞死亡的程序。因此，我们对IGROV1的各组稳转细胞给予了顺铂处理，以诱导p53的表达和乙酰化水平的增
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