内质网蛋白前向输出异常对胰岛素生物合成的影响

发布时间：2021-08-17 16:01

　　目的:胰岛素作为体内最主要降低血糖的激素,对机体葡萄糖的代谢至关重要。胰岛素的生物合成过程起始于在粗面内质网的核糖体上翻译为胰岛素的前体-前胰岛素原。前胰岛素原转位进入内质网后,形成胰岛素的另一个前体-胰岛素原。胰岛素原在内质网中正确折叠后,输出内质网进入高尔基体。在高尔基体中被酶解为胰岛素和C肽。成熟的胰岛素和C肽储存在分泌颗粒中,在葡萄糖刺激下,分泌到细胞外发挥生物学作用。胰岛素作为分泌蛋白,其分泌通路的顺畅对形成足够量有活性的胰岛素是基本保证。胰岛素原转运出内质网的前提条件是胰岛素原必须折叠形成其天然结构,然后被COP-Ⅱ囊泡转运到高尔基体中。研究证实,胰岛素基因突变诱导的青少年糖尿病造成血糖升高是由于胰岛素原在折叠过程中三个二硫键不能正确形成,导致胰岛素原不能形成可以输出内质网的天然状态。有研究报道,野生型胰岛素原在内质网折叠过程中也会形成10%-20%错误折叠的胰岛素原,但当减少野生型胰岛素原输出内质网后,野生型胰岛素原在内质网中的状态变化还不是很清楚,因此本研究拟探讨减少胰岛素原转运出内质网,对胰岛素合成量及胰岛素原状态的影响及对β细胞内质网应激的影响。方法:本研究通过两种... 

【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校

【文章页数】：102 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

胰岛素量降低，胰岛素原分泌量减少.A免疫印迹分析细胞内胰岛素原和胰岛素量及分泌到培养基中胰岛素原和胰岛素的量

免疫荧光染色显示胰岛素原在核周聚集的现象（图2.2），但在过表达 sar-1A 突变体（H79G，T39N）组，胰岛素原核周聚集现象消失，呈现弥散在细胞质中，即使有核周聚集表型，蛋白聚集量也明显减少（图 2.2）。在正常细胞中，高尔基体的免疫荧光表型为核周聚集而内质网的表现为弥散在细胞质中。所以在过表达 sar-1A 突变后，胰岛素原被阻滞在了内质网中，其转运效率明显降低。图 1 Sar-1A 蛋白突变影响 COP-Ⅱ囊泡的组装。A，sec31 蛋白的免疫荧光。MIN6 细胞感染相应腺病毒 24 小时后，对细胞进行固定，渗透，封闭，孵育 1抗和 2 抗

27图 3.1 胰岛素原转运出内质网效率降低导致胰岛素原错误折叠。A 免疫印迹分析 MIN6 细胞中胰岛素原折叠情况。MIN6 细胞感染相应病毒 24 小时后，裂解细胞提取蛋白。加入相应量的非还原上样缓冲液，100℃煮 5 分钟。之后将样品等体积分成 2 份，一份加入样本体积的十分之一的 1M 二硫苏糖醇，另一份不加任何试剂。100℃煮 5 分钟。之后进行还原和非还原免疫印迹实验。B 定量分析胰岛素原低聚体和高分子量胰岛素原与胰岛素原单体的比例。分别用胰岛素原低聚体和高分子量胰岛素原的灰度值除以胰岛素原单体的灰度值,统计学方法：t 检验，*p≤0.05。C 免疫印迹分析 MIN6 细胞中胰岛素原折叠情况。MIN细胞处理 5um BFA5 小时后裂解细胞提取蛋白。加入相应量的非还原上样缓冲液，100℃煮 5 分钟。之后将样品等体积分成 2 份，一份加入样本体积的十分之一的 1M 二硫苏糖醇，另一份不加任何试剂。100℃煮 5 分钟。最后进行还原和非还原免疫印迹实验，检测相应蛋白表达情况。D 定量分析胰岛素原低聚体和高分子量胰岛素原与胰岛素原单体的比例。分别用胰岛素原低聚体和高分子


本文编号：3348068