聚酰胺—胺与聚乙烯亚胺共聚物及其叶酸修饰的基因传递系统的构建及性能研究

发布时间：2017-04-29 20:06

  本文关键词：聚酰胺—胺与聚乙烯亚胺共聚物及其叶酸修饰的基因传递系统的构建及性能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人类目前很多疾病用传统的治疗方法,手段和技术很难治愈或者难达到较好的治疗效果。随着人类基因工程计划的完成,分子生物学及其技术的发展,人们可以从基因水平去认识疾病,发现致病基因,实现基因治疗的可能。基因治疗就是将外源性治疗基因通过载体传送到病变的组织或细胞,沉默非正常的基因表达,替换或者修复有缺陷的基因,从而达到治疗疾病的目的。由于单纯的裸基因在传递的过程中容易被体内的一些生物酶降解而失去治疗作用,因此基因需要载体的传送。研究表明,载体的类型往往决定基因的传递效率,从而决定着治疗的效果。因此,发展有效的基因载体是发展基因治疗的必由之路。目前基因载体分为两类：病毒载体与非病毒载体。病毒载体具有高效的传递效率,至2012年,全世界大概有至少1843例临床试验,取得了一定的成功。但是,病毒基因载体具有潜在的安全性问题,如免疫原性反应,引起基因突变,这些副反应经常会导致病人死亡,因此具有很大的风险。此外,病毒载体还有制造成本高,制备复杂,基因协载量低等问题。基于这些问题,很多研究将目标转向了非病毒基因载体的研究。非病毒载体可以克服病毒载体的安全性问题,但是其传递效率低于病毒载体,往往很难达到满意的治疗效果。因此,发展高效的,高安全性的非病毒载体用于基因治疗非常必要。其中,阳离子聚合物聚酰胺-胺(polyamidoamine, PAMAM)和聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)是两类研究比较多的非病毒基因载体。一般地,高代数的PAMAM和大分子量的PEI都具有高的转染效率,但是伴随着很大的细胞毒性；相反,低代数的PAMAM和小分子量的PEI具有很低的细胞毒性,但伴随着很低的转染效率,而且这两类载体的抗血清能力非常的差,用于临床试验具有很大的挑战。很多研究表明,将小分子的PEI或者低代数的PAMAM通过化学修饰,如通过与生物兼容的材料集成大分子或者与疏水性的材料自组装成纳米粒都可以提高它们的转染效率,而且同时保持相对较低的细胞毒性。尽管如此,非病毒基因载体的传递机制还未完全阐述清楚,这在一定程度上限制了基因载体的发展速度,导致在载体设计时具有盲目性。因此,本研究的重点之一是：合成一种基于低代PAMAM和小分子PEI的共聚物基因载体,期望该载体具有转染效率高和毒性低的特点,并对他们的基因传递机制进行初步揭示,了解它的基因传递过程。另一方面,载体要用于体内基因治疗必须具有一定的稳定性和靶向能力。聚乙二醇化(PEGylation)常常被用来提高载体的稳定性,降低载体与体内阴离子型物质的非特异性结合,延长体内循环时间。另外,PEG还常用作配体和载体的连接剂,既可以保持PEG的优点,同时还可以增加配体-受体结合的能力。虽然这样的策略在一定程度上提高了系统的胶束稳定性和细胞特异性,但是PEG的修饰同样存在一些问题,主要是：降低载体的细胞摄取和溶酶体中逃逸的能力。因此,本研究的重要之二是：构建PEG-配体修饰的PAMAM-PEI靶向基因传递系统,然后尝试通过优化PEG末端配体密度去克服PEG作用降低的细胞摄取和进一步提高载体的转染活力和细胞特异性。根据上面的叙述,我们将论文分成2个部分,第一部分是合成PAMAM-PEI共聚物,对其转染活力和细胞毒性进行评估,初步考察它们的基因传递机制。第二部分工作是根据第一部分的结果去构建一种转染活力更高、毒性更低的PAMAM-PEI的共聚物,然后以此共聚物为基础构建叶酸靶向的基因传递系统。在研究的第一部分,我们将生物兼容性好的PAMAM G1.5和G2.5与毒性低的分支状PEI 1800 Da通过酰胺化反应合成一种以PAMAM为核,PEI为外层的PAMAM-PEI (PAPE)共聚物。通过红外,核磁,GPC对其结构进行了表征。然后考察了PAPE对DNA的压缩能力,复合物的抗核酸酶降解能力,并对PAPE/DNA复合物的粒经,电位,形态进行了测定。对复合物在不同细胞系上的转染效率,毒性进行了评估。最后对其在HEK 293T细胞上的转染机制进行了初步研究。具体的内容如下：(1)以PAMAM G1.5或G2.5为核心,与过量的分支状PEI 1800通过酰胺化反应合成PAMAM为核,PEI为外层的PAMAM-PEI共聚物。以PAMAMG1.5和G2.5为核的共聚物分别被命名为PAPE-1和PAPE-2.用红外(FT-IR),核磁(1H NMR)和凝胶渗透色谱(GPC)对其结构进行表征。结果显示,在PAPEs的红外和核磁图谱上没有PAMAM G1.5和G2.5上的甲酯(-COCH3)特征峰,这是由于PAMAM和PEI发生了酰胺化反应生成了酰胺键导致其消失,且甲酯基全部参与了反应。另外,PAPEs的红外和核磁图谱上出现了PEI和PAMAM的骨架吸收峰,这两点共同证明了PAPE被成功合成。GPC结果表明,PAPE-1和PAPE-2为单峰图谱且具有较小的PDI(～1.2),另外它们的水溶液是澄清透明的,这些说明PAPE成功合成而且在反应过程中没发生交联反应或者程度很低。(2) PAPEs/pDNA复合物生物理化性质的研究。利用凝胶电泳对PAPEs的基因压缩能力进行了评估,发现,PAPE-1和PAPE-2在N/P=2时可以完全阻滞DNA的迁移,能力和PEI 25K相当,但稍弱于PAMAM G5.利用核酸酶降解实验来考察PAPE对DNA的保护能力,发现PAPEs在N/P=2时开始呈现出保护能力且随着N/P的升高而增强。利用马尔文粒经仪对PAPEs/DNA复合物的粒经和电位进行了测量,在所测的N/P范围内,其平均粒径大小处于70-200nm,电位处于+13-+33 mV.经原子力显微镜(AFM)观察,复合物在N/P=25时,呈圆球形或近圆球形形态。(3)对PAPEs/DNA复合物在不同细胞系上的转染活力分别在有无血清的条件下进行了评估。HEK 293T的转染结果表明,PAPEs的转染活力是随着N/P的升高先提高再降低的,在无血清的条件下最优比是N/P=25,有血清条件下的最优转染比是N/P=90.在N/P=25时,PAPEs的转染活力显著高于PEI 25K, PAMAM G5, PEI 1800的最优转染效率,但是弱于商业化转染试剂Lipofectamine 2000 (P0.05)。但是在有血清的转染条件下及N/P=90时,PAPE-1和PAPE-2的转染活力均高于所有的阳性对照(P0.05)。对BEL-7402和COS-7进行转染时发现,不管有无血清,PAPEs的转染活力均高于PEI 25K(P0.05)。另外,PAPE-2在有血清的条件下的转染效率可以达到无血清条件下的水平甚至是更高。这些说明,PAPE-2是一个高效的基因载体且具有一定的抗血清能力。与PAPE-1相比,PAPE-2在血清条件下对HEK 293T, BEL-7402的转染活力更高(P0.05)。然后,通过MTT方法首先测量了PAPEs对HeLa细胞的毒性,然后考察了PAPEs/DNA复合物在最优转染比时对HEK 293T, BEL-7402和COS-7的细胞毒性,PEI 25K作为对照。结果表明,PAPEs对HeLa细胞的毒性在所测浓度范围内均低于PEI25K(P0.05),PAPE-2的毒性在某些高浓度时大于PAPE-1(P0.05)。 PAPEs基因复合物在最优转染比时,各种细胞均可以保持78%以上的活力且显著高于PEI 25K/DNA复合物(P0.05)。因此,PAPE是一类相对比PEI 25K安全的基因载体。(4)利用细胞途径抑制剂来研究PAPEs/DNA进入细胞的机制,利用共聚焦显微镜(CLSM)来观察复合物进入细胞后其在胞内的分布位置,利用溶酶体突破试剂-氯喹来验证复合物是否通过溶酶体,利用aphidicolin对细胞的分裂进行抑制研究细胞分裂对转染效率的影响。结果表明,PAPEs/DNA复合物进入细胞主要是caveolae-mediated pathway (CvME)途径。CLSM观察到大部分复合物没有与溶酶体重叠共定位在一起而且接近细胞核的边缘,这说明大部分复合物不经过溶酶体；为了进一步证实这个现象,细胞转染前用氯喹预处理以促进载体逃离溶酶体从而提高转染效率,但是复合物的转染效率不能提高,这说明复合物具有足够的缓冲能力突破溶酶体或者复合物不经过溶酶体。综合CLSM的结果和氯喹的作用现象,我们推断PAPEs介导的基因传递都不经过溶酶体。当细胞核的分裂被抑制之后PAPE-1和PAPE-2基因复合物的转染效率均显著降低(t=71.811 P=.000；t=42.974 P=.000),这说明复合物入核的方式是由核分裂时“趁机”进入的。在本文的第二部分,鉴于第一部分的结果-PAPE高效的基因传递效率,这很可能归功于它的结构优势,虽然研究也发现它们的细胞毒性虽然较PEI 25K低,但是它的安全浓度范围相对较窄,浓度在30 μg/mL就可以使HeLa细胞丧失～30%的细胞活力,因此我们首先研究了其结构和转染效率、毒性间的关系,期望发现转染效率更高和毒性更低的PAMAM-PEI共聚物。由于阳离子聚合物的毒性是和分子量是成正比的,所以我们采用支化的小分子PEI 423去替代PEI1800与PAMAM G2.5反应合成一种具有薄PEI外层的新型的PAMAM-PEI杂交体(PME),然后对其毒性和转染活力进行了评估。结果表明,PME在所测细胞系上均表现出比PAPE-2更高的转染效率(P0.05)同时也具有抗血清的能力,但同时它的细胞毒性显著低于PAPE-2 (P0.05)。然后,为了进一步提高PME的细胞特异性,我们用PEG, FA1-PEG和FA2-PEG对其进行化学修饰,合成了具有相同PEG取代度但不同叶酸密度的PME作为靶向基因载体,同时考察叶酸密度对提高PME的转染活力和细胞特异性的影响。利用1H NMR和UV对其结构进行了表征。它们对基因的压缩能力,复合物的粒径电位进行了测量,考察了它们的细胞毒性和溶血性,利用流式细胞仪对其转染效率和细胞摄取进行了测定,对其细胞摄取的机制用抑制剂进行了评估,最后比较了它们在HEK293T多细胞球体上的摄取。具体的研究内容如下：(1) PAMAM G2.5与过量的PEI 423通过酰胺化反应合成PAMAM G2.5-PEI 423 (PME).用FT-IR,1H NMR和GPC对其结构进行了表征,结果表明,PME被成功合成。然后对其在多种细胞上的转染活力进行了测定,与PAPE-2相比,PME的转染活力更高(P0.05)。它们对细胞的毒性大小进行析因分析后发现载体的类型对细胞活力有显著影响(F=485.861,P=.000),在每个浓度进一步单独比较,发现PME的细胞活力显著高于PAPE-2 (P0.05)。另外,也发现PME的转染广谱性较强,适合作为基因载体。据此,我们选择PME作为母体去合成不同叶酸密度修饰的基因传递载体。具体的步骤是：先合成FA1-PEG或FA2-PEG,1H NMR证实了它们的结构。然后,利用PEG, FA1-PEG或FA2-PEG修饰去PME,1H NMR和UV表征证明它们被成功合成。根据1H NMR计算,大概每分子PME接上1.69 PEG,1.66 FA1-PEG或1.72 FA2-PEG分子。这些共聚物被分别命名为：PME-(PEG3.5k)1.69, PME-(PEG3.4k-FA1)1.66和PME-(PEG3.4k-FA2)1.72.(2)利用琼脂糖凝胶电泳对共聚物的基因压缩能力进行了评估,结果表明PEGylation没有显著影响PME的基因压缩能力,所有的共聚物在N/P=2时可以完全阻滞DNA的迁移。利用马尔文粒径仪对复合物的粒径和电位进行了测量。复合物在N/P=10的粒径小于200nm和具有大小合适的电位～+12-+22 mV.此外复合物具有较小的PDI(小于0.2),表明粒径比较均一然后对共聚物及其DNA复合物的毒性进行了评估,结果表明PEG化能够降低PME的细胞毒性,且复合物在N/P=10-100时,细胞可以保持80%以上的细胞活力,在高浓度时载体的毒性显著低于PEI 25K (P0.05). PEG化也可以降低载体对红细胞的破坏,经单因素方差分析载体间的溶血程度存在着显著差异(F=872.320 P=.000),进行多重比较发现其溶血大小的顺序是：PEI 25K PME PME-(PEG3.5k)1.69 PME-(PEG3.4k-FA1)1.66或PME-(PEG3.4k-FA2)1.72 (P0.05).(3)共聚物转染活力的评估。对叶酸受体阳性细胞HEK 293T和HeLa细胞转染规律是：PME经PEG化后转染效率显著降低(P0.05),当PEG的末端连上1价FA分子后,转染效率显著提高(P0.05),当PEG的末端连接上2价的FA分子之后,转染效率再次提高(P0.05)。叶酸载体对叶酸受体低表达的A549细胞转染时,它们的转染效率无显著差别。因此表明,PEG末端2价叶酸的修饰优于1价的叶酸修饰,可以更有效地提高载体的转染活力,这个主要是由二价叶酸提高了载体的摄取导致的。因为细胞摄取试验发现,在t=0.5,1和2小时,PME-(PEG3.4k-FA2)1.72复合物的摄取效率和荧光强度均大于PME-(PEG3.4k-FAl)1.66复合物(P0.05)。复合物在HEK 293T多细胞球体上的摄取效率比较显示了同样的规律。CLSM显示PME-(PEG3.4k-FA2)1.72复合物在球体的每个扫描层的荧光强度几乎都强于PME-(PEG3.4k-FAl)1.66复合物。荧光强度定量检测也证明了这个规律,因此,2价叶酸的修饰可以提高载体在多细胞球体上的摄取。而这些高的细胞摄取可能要归功于2价叶酸可以提高叶酸的局部浓度和/或提供更多的受体结合位点。(4)细胞摄取机制的研究。利用游离叶酸和细胞摄取通道抑制剂研究PME-(PEG3.4k-FA2)1.722, PME-(PEG3.4k-FA1)1.66, PME-(PEG3.5k)1.69复合物的细胞摄取机制。叶酸受体阳性细胞经游离叶酸预处理后,细胞表面的叶酸受体将被饱和。叶酸抑制试验结果表明,PME-(PEG3.5k)1.69在HEK 293T,HeLa,A549细胞上的转染效率不受游离叶酸的影响(t=-0.932 P=0.404; t=2.563 p=0.062; t=1.921 P=0.127),但是PME-(PEG3.4k-FA2)1.72和PME-(PEG3.4k-FA1)1.66的转染效率在叶酸受体阳性细胞上都显著降低(t=40.434 P=.000; t=10.023 P=.001) (t=10.328 P=.000; t=14.925 p=.000而在叶酸受体阴性的A549细胞上转染效率变化不显著(t=1.633 P=1.178；t=1.361P=0.245),这些说明PME-(PEG3.4k-FA2)1.72和PME-(PEG3.4k-FA1)166都具有叶酸受体介导的摄取。相比PME-(PEG3.4k-FA1)1.66, PME-(PEG3.4k-FA2)1.72的降幅更大点,说明它更加依赖受体的介导,即特异性更强。内吞途径抑制试验表明PME-(PEG3.5k)1.69/DNA复合物进入细胞的途径是网格蛋白介导的内吞(CME),但随着PEG末端叶酸密度的升高,小窝介导的内吞(CvME)也逐渐变为主要途径。通过本研究主要得出：1)PAPE具有很高的转染活力和相对低的细胞毒性,复合物进入细胞主要通过小窝蛋白调控的内吞作用,此途径可以减少复合物进入溶酶体的量避免被降解,细胞分裂时的核运输,基因表达的规律近似符合玻尔兹曼模型函数；2)利用小分子PEI 423替代PEI 1800与PAMAM G2.5反应可以获得转染效率更高,毒性更低的PAMAM-PEI共聚物(PME);3)PEG末端的二价叶酸修饰比一价叶酸修饰可以更有效地提高PME的细胞特异性和克服PEG引起的细胞摄取降低,进而提高它的转染活力。同时也发现PME-(PEG3.4k-FA2)1.72对叶酸受体阳性细胞具有比PEI 25K更强的转染活力,具有潜在临床应用价值。
【关键词】：非病毒基因载体 聚酰胺-胺 聚乙烯亚胺 聚乙二醇 叶酸受体靶向 基因转染
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R450
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-23
• 第一章 前言23-45
• 1.1 基因治疗23
• 1.2 基因载体23-25
• 1.2.1 病毒型基因载体23-24
• 1.2.2 非病毒型基因载体24-25
• 1.3 基于聚酰胺-胺(PAMAM)的基因传递载体25-30
• 1.3.1 PAMAM的合成方法25-27
• 1.3.2 PAMAM的化学修饰27-30
• 1.3.2.1 结构热活化27-28
• 1.3.2.2 氨基酸修饰28
• 1.3.2.3 PAMAM用于修饰生物兼容性材料28-29
• 1.3.2.4 强缓冲能力试剂的修饰29
• 1.3.2.5 低代PAMAM的交联反应29
• 1.3.2.6 内核修饰29-30
• 1.4 基于聚乙烯亚胺(PEI)的基因传递载体30-35
• 1.4.1 PEI的化学修饰31-35
• 1.4.1.1 大分子量PEI的化学修饰31-32
• 1.4.1.2 小分子量PEI的化学修饰32-35
• 1.5 基因载体PEG修饰后的常见问题及策略35-37
• 1.6 阳离子聚合物介导基因的传递机制37-42
• 1.6.1 细胞摄取机制38-39
• 1.6.2 内涵体/溶酶体逃逸机制39-41
• 1.6.3 入核的机制41-42
• 1.7 本研究目的、意义和内容42-45
• 第二章 PAMAM-PEI(PAPE)聚合物的合成与表征45-57
• 2.1 试剂和仪器45-46
• 2.2 PAMAM的合成46-47
• 2.2.1 PAMAM G-0.5的合成46-47
• 2.2.2 PAMAM G0的合成47
• 2.2.3 PAMAM G1.5和G2.5的合成47
• 2.3 PAMAM-PEI(PAPE)的合成47-48
• 2.3.1 PAPE的红外光谱分析48
• 2.3.2 PAPE的~1H NMR分析48
• 2.3.3 PAPE的GPC分析48
• 2.4 结果与讨论48-56
• 2.4.1 PAMAM的合成49-50
• 2.4.2 PAPE的合成50
• 2.4.3 PAPE的红外表征50-52
• 2.4.4 PAPE的~1H NMR分析52-54
• 2.4.5 PAPE的GPC分析54-55
• 2.4.6 PAPE的结构分析55-56
• 2.5 本章小结56-57
• 第三章 PAPE/pDNA复合物的制备及物理性能57-69
• 3.1 试剂和仪器57-58
• 3.2 LB培养基的配制58
• 3.3 质粒的转化58-59
• 3.4 pEGFP-C1的大提59-60
• 3.5 PAPE/pDNA复合物的制备60
• 3.6 PAPE对pDNA的压缩能力和保护能力分析60-61
• 3.7 PAPE/pDNA复合物的粒径,电位和形态的测定61
• 3.8 统计学分析61
• 3.9 结果与讨论61-68
• 3.9.1 质粒的转化和提取61-62
• 3.9.2 凝胶电泳分析PAPEs的基因压缩能力62-63
• 3.9.3 PAPE/pDNA的抗核酸酶降解分析63-64
• 3.9.4 PAPE/pDNA的粒径、电位和形态测定64-68
• 3.10 本章小结68-69
• 第四章 PAPE的基因转染活力及毒性评估69-83
• 4.1 试剂,细胞和仪器69-70
• 4.2 试验方法70-71
• 4.2.1 细胞培养70
• 4.2.2 体外转染70
• 4.2.3 细胞毒性评估70-71
• 4.3 统计学分析71
• 4.4 结果与讨论71-82
• 4.4.1 聚合物PAPE的体外转染71-78
• 4.4.2 PAPE及其基因复合物的毒性评估78-82
• 4.5 本章小结82-83
• 第五章 PAPE/pDNA复合物的转染机理初探83-98
• 5.1 试剂和仪器83-84
• 5.2 试验方法84-86
• 5.2.1 荧光素标记的DNA制备84-85
• 5.2.2 PAPE/pDNA复合物的摄取途径85
• 5.2.3 PAPE/pDNA复合物经CvME摄取的基因表达动力学85
• 5.2.4 PAPE/pDNA复合物的胞内运输85
• 5.2.5 氯喹和aphidicolin对转染的影响85-86
• 5.3 统计学处理86
• 5.4 结果与讨论86-97
• 5.4.1 质粒DNA的荧光素标记86
• 5.4.2 PAPE/pDNA复合物的摄取途径86-90
• 5.4.3 PAPE/pDNA的基因表达动力学90-92
• 5.4.4 PAPE/pDNA复合物的胞内过程92-94
• 5.4.5 氯喹与aphidicolin对PAPE/pDNA复合物转染效率的影响94-97
• 5.5 本章小结97-98
• 第六章 PME的合成、表征及生物学性能评价98-111
• 6.1 试剂、仪器及细胞98-99
• 6.2 试验方法99-100
• 6.2.1 PAMAM G2.5-PEI 423共聚物(PME)的合成99
• 6.2.2 PME的结构分析99
• 6.2.3 细胞培养99-100
• 6.2.4 转染100
• 6.2.5 细胞毒性评估100
• 6.3 统计学分析100-101
• 6.4 结果与讨论101-110
• 6.4.1 PME的合成与表征101-103
• 6.4.2 聚合物PME转染HEK 293T细胞103-105
• 6.4.3 聚合物PME/pDNA在最优比转染多种细胞系105-108
• 6.4.4 聚合物PME的细胞毒性108-110
• 6.5 本章小结110-111
• 第七章 PME-PEG-FA共聚物的合成、表征及其生物相容性评估111-128
• 7.1 试剂和仪器112
• 7.2 试验方法112-115
• 7.2.1 COOH-PEG_(3.4k)-FA_1和COOH-PEG_(3.4k)-FA_2的合成113
• 7.2.2 PME-PEG_(3.4k)-FA_1,PME-PEG_(3.5k),PME-PEG_(3.4k)-FA_2的合成113-114
• 7.2.3 聚合物的表征114
• 7.2.4 细胞毒性114
• 7.2.5 溶血分析114-115
• 7.3 统计学分析115
• 7.4 结果与讨论115-127
• 7.4.1 COOH-PEG_(3.4k)-FA_1和COOH-PEG_(3.4k)-FA_2的合成及表征115-117
• 7.4.2 PME-PEG_(3.4k)-FA_2,PME-PEG_(3.4k)-FA_1,PME-PEG的合成及表征117-121
• 7.4.3 聚合物及其基因复合物的细胞毒性和复合物的溶血分析121-127
• 7.5 本章小结127-128
• 第八章 聚合物/pDNA复合物的物理性能及体外转染研究128-138
• 8.1 试剂和仪器128-129
• 8.2 试验方法129
• 8.2.1 琼脂糖凝胶阻滞实验129
• 8.2.2 PME-(PEG_(3.4)k-FA_2)_(1.72)/pDNA复合物的粒径和电位测量129
• 8.2.3 体外转染129
• 8.3 统计学分析129-130
• 8.4 结果与讨论130-136
• 8.4.1 压缩能力分析130-131
• 8.4.2 粒径、电位测定131-132
• 8.4.3 聚合物的体外转染132-136
• 8.5 本章小结136-138
• 第九章 PME-(PEG_(3.4k)-FA_2)_(1.72)/pDNA复合物的细胞摄取138-148
• 9.1 试剂和仪器138-139
• 9.2 2D细胞摄取139
• 9.3 3D多细胞球体的摄取139-140
• 9.4 统计学分析140
• 9.5 结果与讨论140-147
• 9.5.1 2D细胞摄取分析140-145
• 9.5.2 3D细胞摄取分析145-147
• 9.6 本章小结147-148
• 第十章 PME-(PEG_(3.4k)-FA_2)_(1.72)/pDNA复合物的细胞摄取机制148-156
• 10.1 试剂和仪器148
• 10.2 叶酸竞争性试验和摄取途径148-149
• 10.3 统计学分析149
• 10.4 结果与讨论149-155
• 10.4.1 载体的细胞特异性和摄取途径分析149-155
• 10.5 本章小结155-156
• 参考文献156-173
• 全文总结与创新点173-175
• 中英文缩写词表175-178
• 致谢178-180
• 攻读博士期间论文成果180-182
• 统计学审稿证明182

  本文关键词：聚酰胺—胺与聚乙烯亚胺共聚物及其叶酸修饰的基因传递系统的构建及性能研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：335516