Nrf2对NAFLD模型鼠Cyp2a5增量表达的调控机制

发布时间：2017-05-02 15:09

  本文关键词：Nrf2对NAFLD模型鼠Cyp2a5增量表达的调控机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一类没有过量饮酒,病理学特征却与酒精性脂肪性肝病(AFLD)相似,表现为肝细胞脂肪变性和脂质贮积的临床综合征。NAFLD疾病谱从轻到重依次包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化四个的病理阶段。NAFLD发病机制极为复杂,目前解释该病发生机制的主要理论为“二次打击”学说。尽管“二次打击”学说的理论已经被普遍接受,导致NAFLD的分子机理至今仍然不清楚。鼠Cyp2a5与人类的Cyp2a6在氨基酸序列上有同源性,在香豆素、尼古丁代谢及外源性药物和致癌物的激活过程中发挥了重要的作用。研究发现病毒性、细菌性及寄生虫性肝炎等易诱发肝癌形成的肝脏疾病中Cyp2a5均是增量表达的。同时,小鼠NAFLD模型组中Cyp2a5的表达量也是升高的。转录因子Nrf2,是细胞氧化应激反应中的关键因子,在肝损伤、脂肪肝、肝纤维化及肝癌等方面具有保护作用。本试验以前期建立的NAFLD模型ICR鼠为试验动物,探讨非酒精性肝损伤时刺激Cyp2a5增量表达的病理生理学变化。再采用Nrf2基因敲除ICR鼠进行非酒精性肝损伤,研究Cyp2a5的表达量,确定Cyp2a5的增量表达是否依赖Nrf2通路,并研究分析Nrf2基因缺失对NAFLD的影响及其作用的分子机制,进一步阐明Cyp2a5在NAFLD损伤中的作用,阐明Nrf2通路在肝损伤时增量调节Cyp2a5中的作用;分析非酒精性肝损伤、Nrf2和Cyp2a5之间的相互作用。高脂饲料诱导8周后,野生型和基因缺失型小鼠血清学结果显示,与对照组小鼠比较,野生型和基因缺失型NAFLD模型组小鼠TC、LDL、GLU、ALT和AST显著升高(P0.01),ALP明显升高(P0.01或P0.05),TP显著降低(P0.01),但TG和HDL变化不明显(P0.05);与野生型对照组小鼠比较,基因缺失型小鼠TC和ALP显著升高(P0.01),HDL明显升高(P0.05),TP均显著降低(P0.01),ALT明显降低(P0.05),但TG、LDL、GLU和AST变化不明显(P0.05);与野生型NAFLD模型组小鼠比较,基因缺失型NAFLD模型组小鼠HDL和ALP显著升高(P0.01),TG、和ALT明显升高(P0.05),LDL均显著降低(P0.01),TC和AST明显降低(P0.05),但TP和GLU变化不明显(P0.05)。肝脏病理学变化显示,对照组小鼠(野生型对照WT-ND和基因缺失型对照KO-ND)肝脏无脂肪变性,小鼠肝细胞形态正常,肝索排列整齐,肝小叶结构正常,细胞中央有大而圆的核,无明显脂肪滴,基本未见炎症细胞。NAFLD模型组小鼠(野生型高脂诱导WT-HFD和基因缺失型高脂诱导KO-HFD)肝细胞核的相对大小不均,发生脂肪变性(小泡和大泡性脂肪变性)并伴有肝细胞坏死和炎性细胞浸润。野生型高脂小鼠肝脏表现出小程度的小泡性脂肪变性,Nrf2基因缺失高脂小鼠肝脏表现出严重的大泡性脂肪变性和温和的小泡性脂肪变性;油红染色后,相比于WT-ND,KO-ND小鼠肝脏有少量的脂肪滴红染;WT-HFD和KO-HFD小鼠肝脏有明显的红色脂肪滴。NAFLD对肝脏抗氧化能力和脂质过氧化的影响结果显示,高脂饲料诱导8周后,肝脏中的GSH、SOD、POD和MDA活性变化与对照组小鼠相比较,野生型和基因缺失型NAFLD模型组小鼠肝脏中GSH和SOD活性明显降低(P0.05或P0.01),而POD和MDA活性明显升高(P0.05或P0.01)。与野生型小鼠相比,基因缺失型NAFLD模型组小鼠肝脏中MDA活性增加49%,但GSH、SOD和POD变化不明显(P0.05)。与野生型对照组小鼠相比,基因缺失型小鼠肝脏中SOD、POD和MDA明显升高(P0.05或P0.01),而GSH活性显著降低(P0.01)。同时,Nrf2下游相关靶基因变化结果显示,与对照组小鼠相比较,野生型和基因缺失型NAFLD模型组小鼠,γ-GCS、Nqo1、GSTA1和HO-1 mRNA表达量明显升高(P0.05或P0.01),而基因缺失型NAFLD模型组小鼠CAT和GCLC m RNA表达量没有明显变化(P0.05)。与野生型NAFLD模型组小鼠相比较,基因缺失型NAFLD模型组小鼠中所有Nrf2下游靶基因表达量明显降低(P0.05或P0.01)。Western blot、免疫组化显示,高脂诱导和脂肪酸诱导后,与对照组相比较,模型组肝细胞质中Nrf2蛋白含量显著降低(P0.01);肝细胞核中Nrf2蛋白含量显著增加(P0.01),说明高脂饲料和脂肪酸诱导后Nrf2发生核转移。NAFLD对肝组织中Cyp2a5表达的影响结果显示,与野生型NAFLD模型小鼠相比较,野生型对照组小鼠Cyp2a5蛋白表达量增加23%,差异显著(P0.05);基因缺失型NAFLD模型小鼠与基因缺失型对照组小鼠相比较,小鼠肝脏Cyp2a5蛋白表达量增加13%;基因缺失型小鼠(NAFLD组和对照组)与野生型小鼠相比较,Cyp2a5蛋白表达量均显著降低(P0.01)。与野生型NAFLD模型小鼠相比较,野生型对照组小鼠Cyp2a5酶活性增加35%,差异显著(P0.01);基因缺失型NAFLD模型小鼠与基因缺失型对照组小鼠相比较,小鼠肝脏Cyp2a5酶活性增加16%;且基因缺失型小鼠肝脏Cyp2a5酶活性显著低于野生型小鼠(P0.01);免疫组化结果显示,在野生型对照组WT-ND小鼠中,肝细胞Cyp2a5的阳性表达量极少;经高脂诱导后,WT-HFD小鼠肝脏中央静脉周围肝细胞中有明显的Cyp2a5表达,表达量显著高于WT-ND小鼠(P0.05)。在基因缺失对照组KO-ND小鼠中Cyp2a5表达量少;在KO-HFD小鼠中Cyp2a5有阳性表达,略高于的KO-ND小鼠,但无显著性差异。综合以上结果,表明高脂诱导Cyp2a5表达的过程中,Nrf2对其具有调节作用。免疫共沉淀检测Nrf2与Cyp2a5蛋白之间的相互作用,结果表明,用anti-Nrf2的多克隆抗体能将Cyp2a5沉淀下来,用anti-Cyp2a5多克隆抗体同样能沉淀下Nrf2,使用Ig G未检测出条带存在。通过8周的高脂诱导,与对照组相比较,NAFLD模型组小鼠肝脏中Nrf2和Cyp2a5蛋白表达含量明显升高(P0.05或P0.01),这些结果表明,肝脏中Nrf2与Cyp2a5蛋白之间存在相互作用。本研究结果表明,高脂诱导肝脏氧化应激的发生与NAFLD疾病密切相关;在NAFLD疾病过程中,Nrf2激活下游抗氧化因子的表达,对肝脏起保护作用;Nrf2参与NAFLD疾病进程中Cyp2a5表达调控。
【关键词】：非酒精性脂肪肝病 氧化应激 Cyp2a5 Nrf2 基因缺失
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.5;R-332
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 1 引言13-24
• 1.1 非酒精性脂肪肝病13-15
• 1.1.1 非酒精性脂肪肝的发病机制13
• 1.1.2 氧化应激与非酒精性脂肪性肝病13-14
• 1.1.3 基因因素对非酒精性脂肪肝的影响14-15
• 1.2 Nrf2在非酒性脂肪肝中的作用15-20
• 1.2.1 肝脂质代谢15-16
• 1.2.2 非酒精性脂肪肝的患病率及病因16
• 1.2.3 肝脏中Nrf2的活化16-17
• 1.2.4 Nrf2对肝脏的保护作用17-18
• 1.2.5 Nrf2对肝脏再生和衰老的影响18
• 1.2.6 Nrf2对肝脏脂质代谢的影响18-19
• 1.2.7 Nrf2对非酒精性脂肪肝的影响19-20
• 1.3 Cyp2a520-23
• 1.3.1 Cyp2a5的诱导因素20-21
• 1.3.2 Cyp2a5的转录调节研究21-22
• 1.3.3 氧化应激与Cyp2a522
• 1.3.4 NAFLD与Cyp2a522-23
• 1.4 研究目的与意义23-24
• 2 材料与方法24-34
• 2.1 试验材料24-27
• 2.1.1 试验动物24
• 2.1.2 主要仪器设备24
• 2.1.3 药品与试剂24-26
• 2.1.4 溶液配制26-27
• 2.2 试验方法27-33
• 2.2.1 NAFLD小鼠模型的制备27-28
• 2.2.2 Nrf2基因缺失对NAFLD抗氧化能力和脂质过氧化的影响28-29
• 2.2.3 Nrf2基因缺失对NAFLD模型鼠抗氧化基因m RNA表达量的影响29-30
• 2.2.4 NAFLD对肝组织细胞中Nrf2蛋白分布的影响30-32
• 2.2.5 Nrf2基因缺失对NAFLD中Cyp2a5表达的影响32
• 2.2.6 肝脏组织中Cyp2a5与Nrf2蛋白之间的相互作用32
• 2.2.7 肝脏组织免疫组化法检测蛋白表达32-33
• 2.3 数据计算及统计分析33-34
• 3 结果与分析34-54
• 3.1 NAFLD小鼠模型的评价34-37
• 3.1.1 小鼠的NAFLD模型制备34
• 3.1.2 小鼠的血清学指标34-35
• 3.1.3 肝脏的病理学变化35-37
• 3.2 NAFLD对肝脏抗氧化能力和脂质过氧化的影响37-40
• 3.3 NAFLD对Nrf2靶基因mRNA 表达量的影响40-44
• 3.4 NAFLD对肝组织细胞中Nrf2蛋白分布的影响44-46
• 3.4.1 肝组织细胞质中Nrf2蛋白表达44-45
• 3.4.2 肝组织细胞核中Nrf2蛋白表达45-46
• 3.5 Nrf2基因缺失对NAFLD模型鼠肝组织中Cyp2a5表达的影响46-49
• 3.5.1 Nrf2基因缺失对NAFLD模型鼠肝组织中Cyp2a5蛋白表达的影响46-47
• 3.5.2 Nrf2基因缺失对NAFLD模型鼠肝组织中Cyp2a5基因表达的影响47-48
• 3.5.3 Nrf2基因缺失对NAFLD模型鼠肝组织中Cy P2a5酶活性的影响48-49
• 3.6 肝脏中Nrf2与Cyp2a5蛋白之间的相互作用49-52
• 3.7 免疫组化法检测肝脏组织中蛋白表达含量52-54
• 3.7.1 免疫组化法检测肝脏组织中Nrf2蛋白表达含量52
• 3.7.2 免疫组化法检测肝脏组织中Cyp2a5蛋白表达含量52-54
• 4 讨论54-59
• 4.1 NAFLD模型的复制54-55
• 4.2 Nrf2基因缺失对下游靶基因及NAFLD的影响55-56
• 4.3 Cyp2a5的转录调控56-57
• 4.4 病理学变化对Cyp2a5的表达的影响57
• 4.5 Nrf2基因缺失对Cyp2a5的表达影响57-58
• 4.6 Nrf2与Cyp2a5蛋白之间的相互作用58-59
• 5 结论59-60
• 致谢60-61
• 参考文献61-79
• 攻读博士学位期间发表的学术论文79

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 R Scott Rector;John P Thyfault;Jamal A Ibdah;;Nonalcoholic fatty liver disease and mitochondrial dysfunction[J];World Journal of Gastroenterology;2008年02期

2 Veronika Zámbó;Laura Simon-Szabó;Péter Szelényi;，

本文编号：341182