乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）通过下调AKT磷酸化促进Fas介导的肝细胞凋亡和肝脏损伤
发布时间：2021-10-19 07:25
Fas受体/配体（Fas/FasL）系统在肝细胞凋亡中起重要作用。当FasL与Fas结合后,会通过Fas相关死亡结构域（Fas-associated death domain,FADD）传递细胞凋亡信号,募集procaspase-8形成死亡诱导信号复合物（death-inducing signaling complex,DISC）,随后激活下游的caspases,从而诱发肝细胞凋亡。表面抗原（HBsAg）是慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者肝脏和外周血中最为丰富的HBV编码蛋白,且HBsAg在Fas调控肝细胞凋亡中的作用目前并未被阐释,因此本文旨在研究HBsAg对Fas介导肝细胞凋亡的影响及机制。本研究第一部分旨在探讨HBsAg对Fas介导肝细胞凋亡的影响。首先我们建立了HepG2-pHBsAg和HepG2-pcDNA3.1混合克隆细胞株并验证表达。通过CCK-8、TUNEL以及AnnexinV实验发现HBsAg增加HepG2细胞对人Fas单克隆抗体anti-Fas CH11诱导细胞凋亡的敏感性,此外HBsAg促进anti-Fas CH11和FasL诱导的人原代肝细胞凋亡。以上结果表明...
【文章来源】：福建医科大学福建省
【文章页数】：110 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
Westernblot及全自动免疫荧光分析仪检测细胞株HBsAg表达A.HepG2-pHBsAg中HBsAg的表达
福建医科大学博士学位论文27图1-3HBsAg对anti-FasCH11处理的HepG2细胞凋亡的影响A.TUNEL检测HepG2-pcDNA3.1和HepG2-pHBsAg细胞株的凋亡。IgM作为anti-FasCH11同型抗体对照，IgG+IgM作为anti-FasZB4+anti-FasCH11同型抗体对照。随机计数5个200倍视野下的凋亡细胞，凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数。*P<0.05。（存在0.5μg/mlActD处理）。B.AnnexinV检测HepG2-pcDNA3.1和HepG2-pHBsAg细胞株的凋亡。细胞处理方法同TUNEL。实验结果进行统计分析。n=3，*P<0.05。C.HepG2-pRep-HBV，HepG2-pRep-HBV-HBsAg(-)，HepG2-pRep-HBV-HBc&HBx(-)和HepG2-pRep-Sal1细胞株中，HBsAg、HBc、HBx的表达。β-tubulin作为内参。D.AnnexinV检测HepG2-pRep-HBV，HepG2-pRep-HBV-HBsAg(-)，HepG2-pRep-HBV-HBc&HBx(-)和HepG2-pRep-Sal1（对照）细胞株的凋亡。1μg/mlanti-FasCH11（存在0.5μg/mlActD）处理4h。实验结果进行统计分析。n=3，*P<0.05。4.HBsAg对anti-FasCH11和FasL介导的人原代肝细胞凋亡的影响考虑到肝癌细胞可能具有异常的死亡调节途径，且CH11是人为制备的anti-Fas抗体，可能与其生理状态的对应物FasL有所不同。为了更好地验证HBsAg功
福建医科大学博士学位论文28能，我们引入人原代肝细胞PHH并以FasL处理，利用caspase-3/7活性实验检测HBsAg是否也能促进细胞凋亡。为此，我们首先以表达HBsAg的重组腺病毒Ad-HBsAg以及Ad-GFP（对照）感染PHH，72h后，在0.5μg/mlActD存在下，以1μg/mlanti-FasCH11或10ng/mlFasL处理细胞4h，检测细胞中caspase-3/7的活性，如图1-4所示，在anti-FasCH11或FasL处理下，Ad-HBsAg组细胞caspase-3/7活性均显著高于对照组（P＜0.05）。提示，HBsAg可促进anti-FasCH11和FasL介导的人原代肝细胞的凋亡。图1-4HBsAg对anti-FasCH11和FasL处理的人原代肝细胞凋亡的影响在1μg/mlanti-FasCH11或10ng/mlFasL处理下（均存在0.5μg/mlActD），caspase-3/7活性实验检测Ad-GFP和Ad-HBsAg感染PHH中caspase-3/7的活性。n=3，*P<0.05。讨论细胞凋亡的形态学表现为细胞皱缩，染色质凝集，胞膜起泡，凋亡小体形成，细胞碎裂[26]。从生化水平来看，细胞凋亡伴随细胞外膜磷脂酰丝氨酸外翻，线粒体膜通透性增加，caspase家族蛋白的活化等[27]，可用AnnexinV、TUNEL以及caspase活性实验检测。生理状态下细胞凋亡对于消除异常肝细胞，维持肝脏稳态至关重要。但大量细胞凋亡是急性肝病的特征，而持续性细胞凋亡则是慢性肝病的病理学特征，在这种情况下，肝细胞凋亡可刺激纤维发生，最终导致慢性肝病中的肝硬化[28]。引起肝细胞凋亡的因素包括病毒感染、酒精摄入、胆汁淤积、脂肪变性、药物滥用和自身免疫等。细胞凋亡的途径包括死亡受体依赖性和线粒体依赖性途径[29,30]。死亡受体依赖的外源性凋亡途径由死亡配体与其同源受体结合触发信号传导，主要有TNF-
本文编号：3444421
【文章来源】：福建医科大学福建省
【文章页数】：110 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
Westernblot及全自动免疫荧光分析仪检测细胞株HBsAg表达A.HepG2-pHBsAg中HBsAg的表达
福建医科大学博士学位论文27图1-3HBsAg对anti-FasCH11处理的HepG2细胞凋亡的影响A.TUNEL检测HepG2-pcDNA3.1和HepG2-pHBsAg细胞株的凋亡。IgM作为anti-FasCH11同型抗体对照，IgG+IgM作为anti-FasZB4+anti-FasCH11同型抗体对照。随机计数5个200倍视野下的凋亡细胞，凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数。*P<0.05。（存在0.5μg/mlActD处理）。B.AnnexinV检测HepG2-pcDNA3.1和HepG2-pHBsAg细胞株的凋亡。细胞处理方法同TUNEL。实验结果进行统计分析。n=3，*P<0.05。C.HepG2-pRep-HBV，HepG2-pRep-HBV-HBsAg(-)，HepG2-pRep-HBV-HBc&HBx(-)和HepG2-pRep-Sal1细胞株中，HBsAg、HBc、HBx的表达。β-tubulin作为内参。D.AnnexinV检测HepG2-pRep-HBV，HepG2-pRep-HBV-HBsAg(-)，HepG2-pRep-HBV-HBc&HBx(-)和HepG2-pRep-Sal1（对照）细胞株的凋亡。1μg/mlanti-FasCH11（存在0.5μg/mlActD）处理4h。实验结果进行统计分析。n=3，*P<0.05。4.HBsAg对anti-FasCH11和FasL介导的人原代肝细胞凋亡的影响考虑到肝癌细胞可能具有异常的死亡调节途径，且CH11是人为制备的anti-Fas抗体，可能与其生理状态的对应物FasL有所不同。为了更好地验证HBsAg功
福建医科大学博士学位论文28能，我们引入人原代肝细胞PHH并以FasL处理，利用caspase-3/7活性实验检测HBsAg是否也能促进细胞凋亡。为此，我们首先以表达HBsAg的重组腺病毒Ad-HBsAg以及Ad-GFP（对照）感染PHH，72h后，在0.5μg/mlActD存在下，以1μg/mlanti-FasCH11或10ng/mlFasL处理细胞4h，检测细胞中caspase-3/7的活性，如图1-4所示，在anti-FasCH11或FasL处理下，Ad-HBsAg组细胞caspase-3/7活性均显著高于对照组（P＜0.05）。提示，HBsAg可促进anti-FasCH11和FasL介导的人原代肝细胞的凋亡。图1-4HBsAg对anti-FasCH11和FasL处理的人原代肝细胞凋亡的影响在1μg/mlanti-FasCH11或10ng/mlFasL处理下（均存在0.5μg/mlActD），caspase-3/7活性实验检测Ad-GFP和Ad-HBsAg感染PHH中caspase-3/7的活性。n=3，*P<0.05。讨论细胞凋亡的形态学表现为细胞皱缩，染色质凝集，胞膜起泡，凋亡小体形成，细胞碎裂[26]。从生化水平来看，细胞凋亡伴随细胞外膜磷脂酰丝氨酸外翻，线粒体膜通透性增加，caspase家族蛋白的活化等[27]，可用AnnexinV、TUNEL以及caspase活性实验检测。生理状态下细胞凋亡对于消除异常肝细胞，维持肝脏稳态至关重要。但大量细胞凋亡是急性肝病的特征，而持续性细胞凋亡则是慢性肝病的病理学特征，在这种情况下，肝细胞凋亡可刺激纤维发生，最终导致慢性肝病中的肝硬化[28]。引起肝细胞凋亡的因素包括病毒感染、酒精摄入、胆汁淤积、脂肪变性、药物滥用和自身免疫等。细胞凋亡的途径包括死亡受体依赖性和线粒体依赖性途径[29,30]。死亡受体依赖的外源性凋亡途径由死亡配体与其同源受体结合触发信号传导，主要有TNF-
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