生物人工肾的优化构建及其治疗多器官功能障碍综合征的作用及机制研究

发布时间：2017-05-09 05:54

  本文关键词：生物人工肾的优化构建及其治疗多器官功能障碍综合征的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：血液净化疗法是急性肾衰竭(ARF)合并多器官功能障碍综合征(MODS)最常用的治疗方法。但ARF合并MODS死亡率仍居高不下,这与目前血液净化技术仅能替代肾小球滤过功能,而不具备替代肾小管的功能,不能完成免疫、重吸收、内分泌及代谢等功能密切相关。生物人工肾小管(RAD)就是利用细胞治疗学和组织工程技术构建出的一种装置,以补充、完善目前血液净化的不足。本课题组成功地应用肾小管上皮细胞(RTCs)构建了RAD,并在国内率先完成了RAD的动物实验。但我们在研究中发现,符合临床实际ARF合并MODS大动物模型的建立、细胞的来源与寿命等问题是RAD基础研究和临床应用的瓶颈。因此,本研究创建缺血性ARF伴严重感染后MODS猪模型,探讨ARF合并MODS与免疫失衡的关系；同时利用骨髓间充质干细胞(MSCs)与RTCs共培养来优化RAD,为RAD提供最适细胞来源；用优化构建的RAD对ARF合并MODS猪模型进行治疗,观察其疗效并探讨其机制。第一部分 急性肾衰竭合并多器官功能障碍模型建立及其免疫功能研究目的：建立ARF伴MODS的猪模型,并探讨ARF伴或不伴MODS动物血清中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)和炎性细胞因子水平是否有显著差异,分析ARF合并MODS发生发展的免疫机制。方法：22只健康杂交猪,随机分为三组。CLP+CRA组(n=12)：接受盲肠结扎穿刺(CLP)造成腹腔感染致MODS,并夹闭肾动脉(CRA)致缺血性ARF；CLP组(n=5)：仅行CLP术；CRA组(n=5)：仅行CRA术。观察其生命体征和主要脏器功能。ELISA方法测定手术后不同时间(0、4、8、16、24和48小时)血清NGAL、TNF-α和IL-6的水平。结果：(1)动物在CLP+CRA术后24-72小时陆续出现：ARF(血肌酐、尿素氮和钾显著升高),肝功能不全(ALT和AST显著增加),平均动脉压下降,肺功能异常,肾、肝、肺和小肠组织出现明显的病理变化。(2)CLP+CRA组、CLP组血清TNF-α浓度8h时达到高峰,显著高于同时间点的CRA组(621.50±207.31pg/ml、597.18±211.57pg/ml vs 194.82±57.06pg/ml, P＜0.01); CLP+CRA组、CLP组IL-6水平24h时显著高于同时间点的CRA组(P0.01)。CLP+CRA组、CRA组血清NGAL浓度在8h时明显高于同时间点的CLP组(463.08±7529ng/ml、 317.42±58.51ng/ml vs 132.67±43.58ng/ml, P0.05)。结论：盲肠结扎和穿孔造成严重腹腔感染致多器官功能障碍,加夹闭肾动脉致肾缺血再灌注性ARF,证明按本法制作ARF合并MODS模型成功、稳定。动态监测其TNF-α、IL-6和NGAL水平,可预测和评估ARF合并MODS的发生情况和严重程度。第二部分生物人工肾中细胞的优化及丹参酮对其影响目的：建立人RTCs与骨髓MSCs体外最适共培养体系,为RAD的构建提供理想细胞来源,并进行共培养的机制研究；同时,观察丹参酮对共培养体系的影响。方法：(1)将人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)和人骨髓MSCs分别按照1：1、3：1、6:1和10：1等不同比例共培养。观察各组HK-2细胞形态和功能变化；检测细胞存活率、细胞色素P450活性和细胞活力；激光共聚焦监测巨蛋白(megalin)表达情况。(2)在HK-2和MSCs最适比例的共培养体系中加入丹参酮ⅡA磺酸钠溶液(含100umol/L丹参酮ⅡA),设为丹参酮组；观察丹参酮ⅡA对共培养体系的影响。流式细胞仪检测与分析HK-2细胞周期变化、凋亡情况(Annexin V-FITC/PI法)；CCK8测定HK-2细胞增殖；ELISA法检测细胞培养上清液中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的水平。结果：(1)通过显微镜观察,HK-2/MSCs 3:1共培养组为各组中HK-2细胞生长最佳；该组HK-2细胞存活率、细胞色素P450、细胞活力和megalin表达量均显著高于其余比例组(P均0.05)。(2)细胞培养24h时,共培养组(HK-2/MSCs=3:1)、丹参酮组HK-2细胞G0-G1期比例较单纯HK-2培养组(HK-2组)明显减少,G2-S期比例则显著增多(P0.05)；共培养组、丹参酮组培养24h、48h、72h细胞调亡率均明显低于HK-2组(24h:1.74±0.03%、1.68±0.01% vs 2.75±0.02%,P0.05)；共培养组、丹参酮组HK-2在24h、48h细胞增殖能力均高于HK-2组(P0.05)；共培养组、丹参酮组在24h、48h时细胞培养上清液中IGF-1和BMP-7水平均高于HK-2组(P0.05)；但上述指标在共培养组与丹参酮组之间均未见显著性差异(P0.05)。结论：HK-2与人骨髓MSCs体外共培养可维持HK-2形态与功能,HK-2与MSCs按3：1比例共培养可最大程度维持HK-2功能,为构建功能性RAD提供了高效细胞材料。最适共培养体系中加入丹参酮ⅡA并未明显促进细胞增殖、减少细胞凋亡及改善其功能。第三部分改良生物人工肾治疗多器官功能障碍猪模型的作用及机制目的：观察骨髓MSCs与HK-2共培养构建的RAD治疗ARF合并MODS猪的效果,探讨其作用机制。方法：ARF并MODS猪随机分为四组：①常规RAD治疗组(A组,n=5),将单纯HK-2培养构建的RAD与血滤器连接,行RAD串联CVVH治疗24小时；②共培养RAD治疗组(B组,n=5),RAD中细胞为共培养后HK-2,余同A组；③假RAD治疗组(C组,n=5),将RAD换为无细胞的假RAD,余同A组；④未血液净化治疗组(D组,n=6)。观察和记录生命体征、生化指标(包括血肌酐、尿素氮、电解质)、血气分析、细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和生存时间。结果：四组动物治疗前MAP无显著性差异,均值为79.13±12.06mmHg; A、B两组治疗4h后血压逐渐回升,24h时B组MAP (101.20±9.37mmHg),显著高于同时间点的A组(93.42±7.35mmHg)、C组(64.75±9.61mmHg)和D组(54.29±3.01mmHg) (P0.05)。四组CWH前SCr无明显差异；治疗24h A、B组SCr水平明显低于C、D组(P0.05),而A、B组之间无显著性差异。B组IL-10的峰值(301.72±46.35pg/m1),明显高于A组(261.33±51.72pg/ml)、C组(130.47±14.97pg/ml)、D组(104.11±10.89pg/ml) (P0.05)。各组治疗开始前血TNF-a水平无统计学差异,均值为519.33±42.16pg/ml; A. B两组治疗开始后血TNF-a水平逐渐下降,24h时均值分别为413.65±33.91pg/ml、329.51±27.64pg/ml,两组有显著性差异(30.05)。A、B、C三组治疗前后血清IL-6水平无明显改变,但D组血清IL-6浓度进行性升高。B组的平均生存时间为124.38±17.09h,明显长于A组(110.97±10.68h)、C组(81.68±9.41h)和D组(75.29±13.71h)(P0.05),前者的平均生存期比后三者分别延长了12.08%、52.28%、65.20%。结论：采用RTCs与骨髓MSCs共培养优化构建的RAD(改良RAD)治疗ARF合并MODS,在延长生存时间和改善生命体征等方面明显优于常规RAD治疗,其机制可能是改良RAD进一步抑制致炎因子产生和增加抑炎因子表达。
【关键词】：多器官功能障碍综合征 生物人工肾小管 骨髓间充质干细胞 白介素-10 肿瘤坏死因子-α 白介素-6
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R459.7;R692.5
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-18
• 参考文献16-18
• 第一部分 急性肾损伤合并多器官功能障碍模型建立及其免疫功能研究18-40
• 材料与方法20-23
• 结果23-33
• 讨论33-36
• 参考文献36-40
• 第二部分 生物人工肾中细胞的优化及丹参酮对其影响40-63
• 材料与方法42-48
• 结果48-58
• 讨论58-60
• 结论60
• 参考文献60-63
• 第三部分 改良生物人工肾治疗多器官功能障碍猪模型的作用及机制63-83
• 材料与方法64-69
• 结果69-77
• 讨论77-80
• 参考文献80-83
• 全文总结83-84
• 附录 综述84-93
• 参考文献89-93
• 英文缩略词表93-95
• 攻读博士学位期间取得的研究成果95-97
• 致谢97-98
• 作者简介98

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 盛志勇;Prevention of multiple organ dysfunction syndrome in patients with extensive deep burns[J];Chinese Journal of Traumatology;2002年04期

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  本文关键词：生物人工肾的优化构建及其治疗多器官功能障碍综合征的作用及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：351887