一氧化氮（NO）对肌损伤炎症反应的干扰效应

发布时间：2017-05-10 13:02

  本文关键词：一氧化氮（NO）对肌损伤炎症反应的干扰效应，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：急性骨骼肌损伤是生活中常见损伤之一,包括机械性损伤,生化毒素,挤压伤、过度负荷、拉伤、挫伤等。无论哪种原因造成的损伤,伤后早期均表现为损伤部位的炎症反应：损伤、坏死的肌纤维释放促炎信号,诱导外周炎症细胞(以中性粒细胞、单核、巨噬细胞为主)向损伤肌组织的移动及肌内浸润,以吞噬坏死肌细胞和崩解的组织碎片,同时分泌多种细胞因子和趋化因子,维持肌内炎症反应并激活肌卫星细胞,活化的成肌细胞持续增殖、分化形成新的肌管以修复损伤的肌纤维,完成肌肉再生。肌内的炎症反应有助于损伤溃变肌纤维的清除,炎性环境也有助于肌纤维的再生修复。然而,剧烈、持续的肌内炎症反应易导致肌组织局部血肿或肿胀、肌内压力增加,抑制成肌细胞增殖,甚至损伤正常的肌纤维,导致愈合期延长、甚至出现瘢痕性修复,影响患者的生存质量[6]。充分研究骨骼肌损伤机制,探讨如何减轻肌损伤后的炎症反应,协调炎症和肌再生的关系,从而提高愈合质量是骨骼肌损伤研究领域的重要课题。一氧化氮(Nitric oxide, NO)是在一氧化氮合酶(NOS)作用下,由L-精氨酸合成的信号分子。在骨骼肌损伤和再生过程中,NO通过下述途径促进骨骼肌的再生修复：ⅰ)促进成肌细胞的活性、增殖及分化；ⅱ)通过扩血管作用增加损伤区血供(为损伤区提供充足的营养和氧气)；ⅲ)上调葡萄糖载体GLUT4水平,提高肌组织的葡萄糖摄取；ⅳ)上调sirtuin-1-依赖性的线粒体合成,提升肌肉的能量代谢。通过促进炎性细胞凋亡、抑制黏附分子(如[CAM, E-selectin, P-selectin)表达,肌源性NO能够降低肌损伤后的炎性反应,降低中性粒细胞介导的肌细胞坏死溶解,降低过氧化物浓度和反应性中间体的形成。作为成肌细胞的力学增值信号分子,NO参与骨骼肌损伤后的卫星细胞激活、增殖及分化,促进损伤肌组织修复。目前关于NO对肌损伤后炎症反应的作用尚存在争议：Hickey等证实iNOS基因敲除小鼠的损伤骨骼肌内炎症细胞的渗出减少；McCafferty和Rigamonti则认为肌肉损伤后iNOS来源的NO可以降低淋巴细胞渗出；Rovere-Querini P课题组的研究发现iNOS基因敲除小鼠损伤肌组织内炎症细胞渗出明显多于对照组。本课题组前期的体外研究证实[19],NO的拮抗剂L-NAME促进C2C12细胞自身抗原及TLR3的表达,而SNP (NO供体)则抑制上述分子的表达。这表明NO可能参与下调骨骼肌炎症反应。为进一步分析NO对损伤诱导的骨骼肌炎症反应的干扰作用,本研究利用Notexin制备小鼠急性肌损伤模型,化学干扰体内NO水平,分析损伤骨骼肌的自身抗原(Mi-2、HARS、 DNA-PKcs和Ku-70)和TLRs(TLR3和T-TLR7)基因及蛋白表达,单核/巨噬细胞的肌内渗出及凋亡,CD8+T细胞的肌内渗出及再生肌纤维MHC-Ⅰ的表达,损伤肌组织内重要的细胞因子(TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-10)和趋化因子(MIP-1α、 MCP-1、MCP-3)的表达差异。生理条件下,肌卫星细胞和成熟的肌纤维均缺乏MHC分子表达。但有研究证实,体外分离培养的人成肌细胞能表达MHC-Ⅰ(人类白细胞抗原I,HLA classI),促炎的细胞因子(女PIFN-γ, TNF-α, IL-1α, IL-1β,或MIP-1α)会进一步上调成肌细胞的HLA-Ⅰ表达。接受IFN-γ刺激后,成肌细胞和分化肌管均表达MHC-Ⅱ分子(HLA class-Ⅱ)。因此有学者指出,骨骼肌细胞是一种兼职的(non-professional)抗原呈递细胞(APC)。有关骨骼肌细胞免疫特性的研究均选用人的成肌细胞及分化肌管。罕有文献报道目前广泛应用的成肌细胞株(如C2C12,L6细胞)、以及来源及扩增更为便利的小鼠原代成肌细胞是否表达MHC分子并具备APC功能。本课题尝试将体外增殖或分化培养的C2C12成肌细胞置于IFN-y诱导的炎性环境中,检测分析IFN-y刺激培养的成肌细胞/分化肌管是否具备炎性细胞特性(能否上调MHC-Ⅰ,并表达MHC-Ⅱ?)NLRP3炎症小体(inflammasome)是先天免疫和获得免疫的联系分子。APC细胞内激活的炎症小体所释放的IL-1β,IL-18,及IL-33以自分泌方式促进APC细胞提高抗原呈递能力,上调共刺激分子和MHC-Ⅱ表达,从而激活抗原特异的T、B细胞反应[26,27,28]。炎症小体的正常活化在维持机体免疫系统稳定中起了重要作用,但持续活化则会导致慢性炎症和自身免疫疾病的发生[29,30]。Mishra等发现NO能抑制NLRP3炎症小体的活化,减少IL-1β的分泌从而抑制由肺结核的产生免疫反应；Kairui Mao证实NO可抑制NLRP3炎症小体的过度活化。尽管炎症小体与自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎,多发性硬化)的相关性已被广泛探讨,却未见文献报道炎症小体是否影响骨骼肌炎症的发生和发展。为探讨炎性环境中的肌细胞是否表达炎症小体并分泌相关的细胞因子,并进一步明确NO是否干扰肌细胞内炎症小体的激活,我们尝试利用IFN-γ刺激小鼠C2C 12成肌细胞并分析炎症小体的形成及活化、IL-1β的分泌。利用L-NAME和SNP处理IFN-γ诱导的C2C12细胞,分析NO是否影响肌细胞的炎性表征。我们的主要研究内容包括：第一章Notexin诱导的急性肌损伤及损伤肌组织NO水平检测[目的]Notexin肌内注射诱导急性骨骼肌损伤,分析损伤肌组织的溃变、炎性渗出、再生特性；检测并对比分析NO的拮抗剂(L-NAME)/供体(SNP)处理前、后损伤肌组织内NO浓度、NOS水平改变。[方法]清洁级雌性C57BL/6小鼠(4-8w)常规饲养,胫骨前肌(tibialis anterrior, TA)注射notexin (O.lmg/kg),分别于Od,4d,7d,10d摘取小鼠TA,冰冻切片,HE及Dystrophin免疫荧光染色。分别于Notexin注射后第1、第4天腹腔注射L-NAME (100mg/kg)和SNP(0.5mg/kg),分别于notexin注射后第4天和第7天摘取TA,提取总RNA, Oligo(dT)逆转录获取cDNA,经特定引物(eNOS,iNOS, nNOS) PCR扩增；组织匀浆后测定NO浓度。结果用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若差异有统计学意义,则采用LSD检验进行两两比较,P0.05认为差异有统计学意义。[结果]HE及Dystrophin荧光染色表明,notexin注射4天时,可见大量的肌纤维坏死及炎性渗出,7天时坏死区被拥有中央核的再生肌纤维替代。10天时肌纤维的再生基本完成。Notexin注射后4天,小鼠肌组织中NO浓度较对照组显著上调(P0.05,n=3)；SNP处理后肌组织NO浓度较之单独损伤组进一步升高(P0.05,n=3)；反之,L-NAME处理会下调肌内NO水平。qPCR结果表明,L-NAME能诱导损伤的TA肌内eNOS, iNOS, nNOS基因表达下调(与单纯的损伤组比较,P0.05,n=3),尤以iNOS下调最为显著。SNP处理不影响NOS基因表达。[结论]Notexin肌内注射能诱发骨骼肌的坏死及炎性渗出。由于notexin诱发的骨骼肌坏死于伤后4天最为广泛,7天后再生的肌纤维完全替代溃变组织,因此我们分别选取4天和7天作为坏死、再生的取材时间点。急性肌损伤后,NOS以及肌源性NO浓度快速上调。SNP能进一步上调损伤肌组织NO浓度,L-NAME则下调肌内NO浓度。L-NAME能抑制肌内NOS基因的表达,尤其抑制iNOS基因水平。第二章NO对损伤骨骼肌炎症反应的干扰效应[目的]体内干扰NO水平(NO供体SNP,或拮抗剂L-NAME腹腔注射)。分析损伤TA肌组织内自身抗原(Mi-2、HARS、DNA-PKcs、Ku-70)、TLRs(TLR3和TLR7)表达改变,肌内淋巴细胞的渗出特性及凋亡改变,肌内细胞因子(TNF-α、TGF-β、 IL-6和IL-10)和趋化因子(MIP-1α、MCP-1、MCP-3)的水平改变。通过上述研究,明确体内NO浓度改变是否影响急性损伤的骨骼肌组织炎性反应。[方法]TA肌内注射notexin (0.1mg/kg),肌损伤后第2天腹腔注射L-NAME(100 mg/kg)或SNP (0.5 mg/kg),7天取材的动物于损伤后第4天再次腹腔注射L-NAME或SNP。分别于损伤后第4天、7天摘取小鼠TA肌,提取肌组织总RNA, Oligo(dT)逆转录获取cDNA,引物PCR扩增检测自身抗原、TLRs、细胞因子(TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-10)和趋化因子(MIP-1α、MCP-1、MCP-3);提取TA肌总蛋白,SDS/PAGE电泳分离转膜,ECL化学发光法检测自身抗原、TLRs的蛋白表达；TA肌冰冻切片,免疫荧光检测肌内渗出的CD11bs、F4/80、 CD3/CD8、MHC-Ⅰ (H-2Kb)、caspase-3日性细胞。组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若差异有统计学意义,则采用LSD检验进行两两比较,P0.05认为差异有统计学意义。[结果]Notexin注射4天时,TA肌内自身抗原(Mi-2、HRS和Ku-70)和TLR3的mRNA及蛋白水平显著上调。L-NAME处理进一步上调自身抗原和TLR3的表达水平,但SNP处理则下调上述分子水平。HE染色及免疫荧光观察发现,损伤4天时,肌纤维广泛坏死崩解,可见大量的炎性细胞渗出,渗出细胞多为单核细胞/巨噬细胞(CD11b+、F4/80+)。7天时,仍可见少量渗出的单核/巨噬细胞,Dystrophine阳性的再生肌纤维大量出现。荧光图像定量分析表明,肌损伤4天时CDllb,或F4/80的平均荧光强度显著增高,7天时下降,但仍高于正常肌组织。L-NAME处理组4天和7天时CD11b或F4/80的平均荧光强度均显著高于单纯损伤组,SNP处理则降低炎性细胞的荧光强度值。对CD11b+caspase-3+细胞的观察和计数均支持SNP处理促进单核细胞凋亡。qPCR结果表明,Notexin注射诱导损伤肌内TGF-p(4d和7d)和IL-10(4d)mRNA水平升高,但L-NAME和SNP不影响上述分子表达。4d和7d时均可见,SNP显著下调TNF-α和IL-6、MIP-1α, MCP-1,和MCP-3 mRNA水平,L-NAME的作用相反,上调TNF-α、 IL-6、MIP-1α, MCP-1,和MCP-3 mRNA水平。肌损伤4天时,我们未观察到CD3ε+CD8a+细胞,以及H-2K b+肌纤维。7d时,肌间隙内可见少量CD8α+T细胞和H-2K b+肌纤维。我们发现,L-NAME处理后,CD8α+T细胞和H-2Kb+肌纤维的数量显著增加。[结论]骨骼肌损伤后上调的肌源性NO干扰肌内炎症反应,抑制骨骼肌自身抗原(Mi-2、HRS、Ku-70)和TLR3的表达,减少单核/巨噬细胞渗出,促进炎性细胞凋亡。同时,NO参与下调肌内的促炎因子和趋化因子,并可能抑制损伤肌组织内再生肌纤维MHC-Ⅰ分子的表达及CD8α+T细胞的渗出。上述结果表明,NO参与下调骨骼肌损伤性炎症反应。第三章NO对体外炎性培养的成肌细胞/分化肌管免疫特性的干扰作用[目的]分析炎性环境(DFN-γ刺激)能否诱导C2C12成肌细胞/分化肌管表达MHC分子及活化的NLRP3炎症小体、明确NO是否干扰C2C12细胞内炎症小体的活化。[方法]复苏冻存的C2C12细胞,37℃ 5%CO2培养箱中以1×105/mL密度接种于6孔板贴壁增殖培养,或采用2%马血清分化培养。分别添加IFN-γ (0.6ug/ml)至增殖、或分化培养的C2C12细胞。采用L-NAME(2.7ug/ml)及SNP(8.94ug/ml)处理IFN-γ干扰48h的分化细胞。分别于IFN-γ刺激后24h、48h,或L-NAME及SNP处理分化细胞6h后收集细胞、提取总RNA及总蛋白,qPCR和Western blot检测MHC-Ⅰ(H-2Kb)、MHC-Ⅱ、ASC, NLRP3, caspase-1。ELISA技术检测上述C2C12细胞培养基上清中IL-1β蛋白浓度。结果用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若差异有统计学意义,则采用LSD检验进行两两比较,P0.05认为差异有统计学意义[结果]IFN-γ刺激培养后,增殖的成肌细胞和分化肌管均显著上调MHC-Ⅰ mRNA及蛋白水平,并表达MHC-Ⅱ。qPCR、免疫荧光、免疫印迹检测均证实,IFN-γ诱导成肌细胞/分化肌管上调NLRP3、ASC和mature-caspase-1表达水平。ELISA分析进一步证实,较之未刺激的细胞,IFN-γ诱导会显著上调C2C12细胞培养基中的IL-1β浓度。SNP处理后6h,分化肌管(IFN-γ刺激48h)内炎症小体(ASC, NLRP3, caspase-1) mRNA和蛋白水平较单纯刺激细胞显著下调,L-NAME则上调ASC, NLRP3, caspase-1表达水平。与上述结果一致,SNP和L-NAME处理同时下调、或上调培养基中IL-1β浓度。[结论]炎性刺激可诱导成肌细胞/再生肌纤维(肌管)成为兼职的APC细胞,并表达MHC分子。表达MHC分子的成肌细胞/分化肌管具备合成并活化NLRP3炎症小体的能力。NO可能是肌细胞免疫特性的干扰因素之一
【关键词】：一氧化氮 肌损伤 炎症 C2C12细胞 炎症小体
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R685
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-26
• 参考文献22-26
• 第一章 Notexin诱导急性肌损伤及损伤肌组织NO水平检测26-38
• 1 材料和方法26-31
• 2 结果31-35
• 3 讨论35-36
• 4 结论36
• 5 参考文献36-38
• 第二章 NO对损伤骨骼肌炎症反应的干扰效应38-70
• 1 材料和方法38-49
• 2 结果49-65
• 3 讨论65-67
• 4 结论67
• 5 参考文献67-70
• 第三章 NO对体外炎性培养成肌细胞/分化肌管免疫特性的干扰作用70-105
• 1 材料与方法70-82
• 2 结果82-102
• 3 讨论102-103
• 4 结论103
• 5 参考文献103-105
• 全文小结105-106
• 综述106-114
• 参考文献110-114
• 中英文对照缩略词表114-116
• 成果116-117
• 致谢117-120
• 统计学合格证明120

  本文关键词：一氧化氮（NO）对肌损伤炎症反应的干扰效应，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：354780