右旋龙脑促进姜黄素类化合物抑制HepG2肝癌细胞增殖的分子机制研究

发布时间：2017-05-10 22:06

  本文关键词：右旋龙脑促进姜黄素类化合物抑制HepG2肝癌细胞增殖的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着社会的发展、人民生活水平的提高和健康意识的增强,加上由于营养比例和结构失衡导致的癌症发生率逐年上升,人们对饮食的需求已从量的满足转向对质的重视,希望通过合理的饮食结构安排,科学摄入营养成分,从而增强身体素质,预防和减少癌症的发生。膳食植物中的天然活性物质由于其具有良好的清除自由基的抗氧化作用产生的抗肿瘤作用效应,因而,被誉为人类“第八大营养素”。姜黄素类化合物(姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素)是从姜黄等天然植物中提取的一种多酚类化合物,常作为天然色素和调味品广泛应用于食品工业,研究表明,它具有广谱的抗肿瘤活性。然而,存在于食品中的姜黄素类化合物被人体吸收后生物利用度较低,难以发挥应有的抗氧化和抗肿瘤等活性功效,极大限制了它们的应用范围及应用价值。签于此,本文选取了在食品中作为食用香精的右旋龙脑(NB)作为吸收促进剂,考察其促进姜黄素类化合物抑制肿瘤细胞生长的影响,明确NB促进姜黄素类化合物抑制肿瘤细胞生长的分子机制。该研究有望揭示NB促进姜黄素类化合物抗肿瘤的分子作用机制,为姜黄素类化合物与NB等天然营养因子的高效、精准利用提供理论基础,也为癌症等慢性疾病的饮食预防干预提供理论依据。在研究中,主要选取Hep G2肝癌细胞作为研究对象,考察NB促进姜黄素类化合物抑制Hep G2肝癌细胞生长的影响并阐明其相关分子机制。一、筛选NB和姜黄素类化合物联合处理的最佳配比及处理时间首先,采用MTT方法考察NB和姜黄素类化合物在不同浓度下单独作用不同时间对Hep G2细胞存活率的影响。结果表明,随着姜黄素(Cur)的浓度和时间的增加,Hep G2细胞的存活率呈逐渐下降的趋势,说明,Cur抑制Hep G2细胞生长呈浓度和时间依赖性;而去甲氧基姜黄素(DCur)和双去甲氧基姜黄素(BDCur)只表现出浓度依赖性。姜黄素类化合物的抗肿瘤效果依次为CurDCurBDCur,表明,随着甲氧基数目的减少,姜黄素类化合物抗肿瘤效果降低。在不同浓度下,NB单独作用于Hep G2肝癌细胞均没有表现出明显的抑制作用。然后,选取NB和姜黄素类化合物在不同浓度下进行不同组合配比,考察其联合处理不同时间对Hep G2细胞存活率的影响。结果表明,NB能显著提高姜黄素类化合物的抗肿瘤活性,且当20μg/ml NB与20μM Cur、40μM DCur、40μM BDCur分别联合作用24 h时对细胞的抑制作用最大。故,选择在这一浓度下处理24 h进行后序的实验。二、考察姜黄素类化合物进入细胞的途径及其在细胞中的作用部位采用荧光分光光度法考察姜黄素类化合物在Hep G2肝癌细胞内的含量,并深入探讨姜黄素类化合物进入细胞的途径,阐明姜黄素类化合物在细胞内的吸收机制。进一步运用荧光显微镜考察姜黄素类化合物在细胞中的定位,从而明确其在细胞中的分布。结果表明,NB能显著提高姜黄素类化合物在Hep G2细胞内的含量,从而提高其抗肿瘤活性。进一步研究发现,NB与姜黄素类化合物联合作用Hep G2肝癌细胞后,姜黄素类化合物主要通过转铁蛋白受体运输姜黄素类化合物进入细胞并定位在胞浆内激活下游信号发挥作用。三、考察NB提高姜黄素类化合物抗肿瘤活性的增效机理采用Western blot和细胞膜通透性实验考察NB提高姜黄素类化合物抗肿瘤活性的增效机理。结果表明,NB能够提高Hep G2细胞的细胞膜通透性,使得更多的姜黄素类化合物进入细胞,而且,NB能够下调转运蛋白ABCB1、ABCC1和ABCG2的表达量,减少姜黄素类化合物从细胞内泵出,从而提高姜黄素类化合物在细胞内的含量。以上两个原因的共同作用贡献了NB增效机理。四、考察NB促进姜黄素类化合物抑制Hep G2肝癌细胞增殖的分子机制采用流式细胞术、Western blot方法、DHE荧光光谱法和蛋白组学方法系统研究NB促进姜黄素类化合物抑制Hep G2肝癌细胞增殖的分子机制。结果表明,相比姜黄素类化合物,NB与姜黄素类化合物联合处理Hep G2细胞后显著提高了G2/M期的细胞数目,表明,NB促进姜黄素类化合物诱导细胞发生G2/M期阻滞。进一步的机理研究表明,NB与姜黄素类化合物联合作用显著减低了细胞周期蛋白cyclin B1及其激酶cdc2的表达量及增加了磷酸化的p53、ATM和MDM2蛋白的表达量,说明,NB与姜黄素类化合物联合作用启动了p53信号传导通路。并且,Akt和ERK1/2磷酸化表达水平的下调和JNK与p38MAPK磷酸化表达水平的上调在启动p53通路中发挥了重要的作用。蛋白组学研究表明,PSMA5、NPM和hn RNPC1/C2蛋白在NB与姜黄素联合调控p53通路中也发挥了重要的作用。研究还发现,活性氧(ROS)是NB与姜黄素类化合物联合诱导细胞发生G2/M阻滞信号通路的源头。因此,NB促进姜黄素类化合物抑制Hep G2细胞增殖是通过介导ROS过量产生从而启动p53通路激活下游信号诱导Hep G2细胞发生G2/M期细胞周期阻滞。
【关键词】：右旋龙脑 姜黄素类化合物 HepG2肝癌细胞 活性氧 p53通路
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-16
• 英文缩略词表16-17
• 第一章 绪论17-44
• 1.1 膳食干预预防慢性非传染性疾病概述17-19
• 1.2 姜黄素类化合物的概述19-28
• 1.2.1 姜黄素类化合物的化学成分、结构和性质19-23
• 1.2.2 姜黄素类化合物的构效关系23-25
• 1.2.3 姜黄素类化合物的抗肿瘤机理25-27
• 1.2.4 姜黄素类化合物在食品中的应用27-28
• 1.2.5 姜黄素类化合物在应用中存在的问题28
• 1.3 右旋龙脑概述28-31
• 1.3.1 右旋龙脑的简介28-29
• 1.3.2 右旋龙脑促进药物跨膜吸收的研究现状29-30
• 1.3.3 右旋龙脑在抗肿瘤领域的研究现状30-31
• 1.4 细胞凋亡机制概述31-35
• 1.4.1 线粒体途径（mitochondria-mediated pathway）31-32
• 1.4.2 死亡受体途径 (death receptor-mediated pathway)32-34
• 1.4.3 细胞周期调控34-35
• 1.5 细胞信号传导通路概述35-38
• 1.5.1 MAPK通路对细胞周期的调节35-36
• 1.5.2 P13K/AKT通路对细胞周期的调节36-37
• 1.5.3 p53 通路对细胞周期的调节37-38
• 1.6 蛋白组学概述38-41
• 1.6.1 蛋白质组学的研究内容38
• 1.6.2 蛋白质组学的研究方法38-41
• 1.7 本课题的研究意义和研究内容41-44
• 1.7.1 本课题的研究意义41-43
• 1.7.2 本课题的研究内容43-44
• 第二章 右旋龙脑联合姜黄素类化合物对HepG2 细胞生长影响初探44-63
• 2.1 引言44-45
• 2.2 实验材料与仪器设备45-46
• 2.2.1 材料与试剂45
• 2.2.2 仪器与设备45-46
• 2.3 实验方法46-50
• 2.3.1 溶液的配制46-48
• 2.3.2 细胞的培养48-49
• 2.3.3 细胞处理与形态观察49
• 2.3.4 MTT测定细胞存活率49-50
• 2.4 实验结果与讨论50-61
• 2.4.1 姜黄素类化合物对HepG2 和L02 细胞生长的影响50-53
• 2.4.2 右旋龙脑对HepG2 和L02 细胞生长的影响53-54
• 2.4.3 右旋龙脑联合姜黄素类化合物对HepG2 和L02 细胞生长的影响54-61
• 2.5 本章小结61-63
• 第三章 右旋龙脑联合姜黄素类化合物对HepG2 细胞的作用靶点研究63-76
• 3.1 引言63-64
• 3.2 实验试剂与仪器设备64-65
• 3.2.1 材料与试剂64
• 3.2.2 仪器与设备64-65
• 3.3 实验方法65-67
• 3.3.1 溶液的配制65
• 3.3.2 细胞培养65
• 3.3.3 细胞内姜黄素类化合物含量的测定65-66
• 3.3.4 细胞内姜黄素类化合物的定位测定66-67
• 3.3.5 Tf、FA和RGD封闭实验67
• 3.4 实验结果与讨论67-75
• 3.4.1 姜黄素类化合物的标准曲线67-68
• 3.4.2 细胞内姜黄素类化合物的含量68-70
• 3.4.3 细胞内姜黄素类化合物的定位70-71
• 3.4.4 姜黄素类化合物进入细胞的途径71-75
• 3.5 本章小结75-76
• 第四章 右旋龙脑促进姜黄素类化合物在HepG2 细胞中吸收的机理研究76-90
• 4.1 引言76-77
• 4.2 实验试剂与仪器设备77-79
• 4.2.1 材料与试剂77-78
• 4.2.2 仪器与设备78-79
• 4.3 实验方法79-83
• 4.3.1 溶液的配制79-80
• 4.3.2 蛋白质样品的准备80-81
• 4.3.3 Western blot检测ABC家族蛋白81-83
• 4.3.4 YO-PRO-1 染色检测细胞膜通透性83
• 4.4 实验结果与讨论83-88
• 4.4.1 右旋龙脑联合姜黄素类化合物对ABCB1 耐药蛋白的影响83-85
• 4.4.2 右旋龙脑联合姜黄素类化合物对ABCC1 和ABCG2 耐药蛋白的影响85-86
• 4.4.3 右旋龙脑对细胞通透性的影响86-88
• 4.4.4 右旋龙脑促进姜黄素类化合物吸收的物理模型88
• 4.5 本章小结88-90
• 第五章 右旋龙脑联合姜黄素类化合物抑制HepG2 细胞增殖的机理研究90-108
• 5.1 引言90
• 5.2 实验试剂与仪器设备90-91
• 5.2.1 材料与试剂90-91
• 5.2.2 仪器与设备91
• 5.3 实验方法91-94
• 5.3.1 溶液的配制91
• 5.3.2 流式细胞术检测细胞周期91-93
• 5.3.3 蛋白样品的准备93
• 5.3.4 Western blot检测93
• 5.3.5 ROS检测93-94
• 5.3.6 NAC预处理对细胞存活率的影响94
• 5.4 实验结果与讨论94-106
• 5.4.1 右旋龙脑联合姜黄素类化合物对HepG2 细胞的细胞周期分布的影响94-96
• 5.4.2 右旋龙脑联合姜黄素类化合物对细胞周期蛋白cyclin B1 及其激酶cdc2 活性的影响96-99
• 5.4.3 右旋龙脑联合姜黄素类化合物对MAPK通路和Akt通路的影响99-102
• 5.4.4 右旋龙脑联合姜黄素类化合物对ROS产生的影响102-105
• 5.4.5 右旋龙脑与姜黄素类化合物引起细胞发生G2/M期阻滞涉及的信号通路图105-106
• 5.5 本章小结106-108
• 第六章 基于蛋白组学技术分析右旋龙脑联合姜黄素类化合物抑制HepG2 细胞增殖的分子机制108-133
• 6.1 引言108
• 6.2 实验试剂与仪器设备108-110
• 6.2.1 材料与试剂108-110
• 6.2.2 仪器与设备110
• 6.3 实验方法110-120
• 6.3.1 流式细胞实验110
• 6.3.2 蛋白组学的方法步骤110-119
• 6.3.3 蛋白样品的准备119
• 6.3.4 Western blot检测119-120
• 6.3.5 ROS检测120
• 6.3.6 NAC预处理对细胞存活率的影响120
• 6.3.7 NAC预处理对细胞周期的影响120
• 6.3.8 NAC预处理对p53、p21 和p-histone的影响120
• 6.4 实验结果与讨论120-131
• 6.4.1 右旋龙脑联合姜黄素对HepG2 细胞的细胞周期分布的影响120-121
• 6.4.2 右旋龙脑联合姜黄素处理HepG2 细胞后蛋白组学分析121-126
• 6.4.3 右旋龙脑联合姜黄素对PSMA5、NPM和nhRNPC1/C2 蛋白的影响126-128
• 6.4.4 右旋龙脑联合姜黄素对cdc2 和cyclin B1 蛋白的影响128-129
• 6.4.5 右旋龙脑联合姜黄素对ROS产生的影响129-131
• 6.4.6 右旋龙脑与姜黄素引起细胞发生G2/M期阻滞涉及的信号通路图131
• 6.5 本章小结131-133
• 结论与展望133-136
• 参考文献136-158
• 攻读博士学位期间取得的研究成果158-160
• 致谢160-162
• 附件162

【参考文献】

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