MicroRNA-155对动脉粥样硬化炎症的调控作用及机制研究

发布时间：2017-05-11 00:14

  本文关键词：MicroRNA-155对动脉粥样硬化炎症的调控作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景及目的:急性冠脉综合征(acute coronary syndrome ACS)是以冠状动脉粥样硬化斑块破裂或糜烂,继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征。ASC是冠心病的一种严重类型,致死率较高,其风险主要来自于不稳定斑块,病理上称为易损斑块。易损斑块的特征为较薄的纤维帽、大量脂质构成的核心,以及斑块肩部累积的丰富的巨噬-泡沫细胞炎症因子。临床和病理学研究都表明,持续的慢性炎症对血管的刺激在动脉粥样硬化中的扮演着关键性的角色。单核细胞迁移进入血管内皮转化为巨噬细胞后,吞噬斑块中累积的脂质形成泡沫细胞,分泌大量的炎症因子并在斑块内堆积,是促进斑块发生发展的重要因素。目前认为减少单核细胞募集和炎症是延缓动脉粥样硬化的进展、稳定动脉粥样硬化易损斑块的关键环节之一。因此,炎症反应的免疫调节分子在动脉粥样硬化中发挥着关键的调节作用。研究发现,小分子RNA(Micro RNAs,mi RNAs)能对免疫及炎症反应起到显著的调节作用,该作用主要是通过导致其靶标分子m RNA的降解或翻译的抑制,调节靶标分子转录后水平的基因表达。有研究显示动脉粥样硬化时mi R-155的水平明显增高,并可通过不同的靶标分子对动脉粥样硬化发挥调节作用。同时,micro RNA-155(mi R-155)也是一个与炎症有关的mi RNAs,能够通过作用于不同的靶标分子调控巨噬细胞炎症反应。但mi R-155对动脉粥样硬化炎症和斑块稳定性的影响及机制仍不明确,有待进一步研究。为此,本课题计划首先筛选与动脉粥样硬化炎症相关的mi R-155的靶标分子并通过实验验证,然后观察mi R-155及其靶标分子对ox LDL刺激的巨噬细胞炎症的影响,最后采用antagomir对动脉粥样硬化小鼠mi R-155的表达进行干预,观察mi R-155表达抑制是否有利于改善动脉粥样硬化炎症及斑块稳定性,为动脉粥样硬化治疗的研究提供基础。方法:1.生物信息学分析并鉴定THP-1细胞中mi R-155的靶标分子(1)利用靶标分析软件Target Scan、Miranda预测,结合文献查阅,筛选出动脉粥样硬化炎症相关的mi R-155靶基因;(2)构建作用靶点双萤光素酶报告载体,与mi R-155 mimic(过表达mi R-155)或inhibitor(抑制mi R-155表达)共转染至PMA诱导的THP-1细胞中,观察mi R-155是不是能够与靶基因3′-UTR区中预测的位点结合;(3)实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot(WB)检测mi R-155对靶标分子m RNA和蛋白表达的影响。2.mi R-155及si RNA干扰靶标分子对ox LDL刺激的THP-1巨噬细胞炎症的影响:(1)PMA诱导24h,ox LDL(50μg/ml)刺激THP-1巨噬细胞24h,mi R-155 mimic、inhibitor及mi R-155靶标分子si RNA分别转染24h后收样;(2)实时定量PCR法、ELISA法检测炎症因子TNF-α、IL-1β、趋化因子CCL2、CCL4和CCL7的表达变化情况;(3)Western blot检测STAT3和IκBα的磷酸化水平,ELISA法检测NF-κB活化水平。3.干扰动脉粥样硬化模型小鼠体内mi R-155水平对其炎症及斑块进展的影响:(1)通过antagomir-155的使用,建立mi R-155表达抑制的动脉粥样硬化小鼠模型:Apo E-/-小鼠(6周龄)高脂喂养12周,将模型小鼠按照mi R-155对照组和mi R-155抑制组分组,每组16只,分别尾静脉注射生理盐水配制的antagomir control和antagomir-155,连续注射3天,继续喂养3周后处死,收集外周血、骨髓单核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMCs)和胸腹主动脉组织以检测各项指标。(2)取主动脉行石蜡切片,HE染色检测主动脉斑块的形态,MASSON染色检测斑块内胶原的沉积情况,免疫组织化学法检测斑块内巨噬细胞(CD68)、平滑肌(SMA)和我们预测的mi R-155靶标分子的表达情况。(3)实时定量PCR法分别检测mi R-155水平变化情况。(4)实时定量PCR法、ELISA法检测趋化因子TNF-α、IL-1β、CCL2、CCL4和CCL7的表达变化情况。(5)Western blot检测STAT3和IκBα的磷酸化水平,ELISA法检测NF-κB活化水平。4.统计学分析:实验所得数据资料用均值±标准差(mean±SD)的方式表示。数据通过SPSS 15.0软件进行t检验(t-student)或单因素方差分析比较(One-way ANOVA),以P0.05为有显著性差异。结果:1.利用生物信息学软件预测到mi R-155的靶基因:细胞因子信号转导抑制因子-1(suppressor of cytokine signaling-1,SOCS1)和Sirtuin1(SIRT1);2.通过构建含mi R-155作用靶点的双荧光素酶报告载体和GFP报告载体,证实了mi R-155能与SOCS1、SIRT1 m RNA上预测的结合位点结合;结果表明,mi R-155能显著抑制SOCS1、SIRT1 m RNA及蛋白水平的表达(P0.05)。3.mi R-155对ox LDL刺激的THP-1巨噬细胞炎症的影响:(1)实时定量PCR结果显示mi R-155在ox LDL刺激的THP-1巨噬细胞中表达显著上调(P0.01)。(2)mi R-155表达抑制时,实时定量PCR及ELISA结果显示TNF-α、IL-1β、CCL2、CCL4和CCL7的m RNA及蛋白水平均显著降低(P0.01),NF-κB转录活性也明显降低(P0.05);当mi R-155过表达及si RNA干扰SOCS1、SIRT1后,TNF-α、IL-1β、CCL2、CCL4和CCL7的m RNA及蛋白水平显著升高(P0.01),NF-κB转录活性也明显升高(P0.05)。(3)Western Blot结果显示mi R-155抑制时,IκBα、STAT3磷酸化水平显著降低,mi R-155过表达及si RNA干扰SOCS1后,IκBα、STAT3磷酸化水平显著升高;此外,当mi R-155抑制时,p65乙酰化水平降低,而mi R-155过表达及si RNA干扰SIRT1后,p65乙酰化水平增加。(4)Transwell实验结果显示mi R-155表达抑制可降低THP-1巨噬细胞的迁移能力,而mi R-155过表达及si RNA干扰SOCS1、SIRT1后,THP-1巨噬细胞的迁移能力有所增加(P0.05)。3.干扰动脉粥样硬化模型小鼠体内mi R-155水平对其炎症及斑块进展的影响:(1)尾静脉注射antagomir-155,实时定量PCR检测小鼠血清、血管组织及BMMCs中mi R-155的水平均显著降低(P0.01),成功建立了mi R-155表达抑制的动脉粥样硬化模型小鼠。(2)antagomir-155抑制mi R-155的水平后,小鼠血清内TNF-α、IL-1β、CCL2、CCL4和CCL7的表达水平显著降低(P0.01),同时可显著减少斑块内的巨噬细胞、增加胶原含量及平滑肌细胞(P0.05)。(3)antagomir-155作用后,动脉粥样硬化斑块内及血管组织中的SOCS1、SIRT1均增加,同时STAT3、IκB磷酸化水平降低,NF-κB的转录活性也降低(P0.05)。结论:1.预测并验证了hsa-SOCS1和hsa-SIRT1为hsa-mi R-155的靶标分子;此外,mi R-155对SOCS1和SIRT1的抑制作用可能是通过介导它们m RNA的降解。2.mi R-155可促进ox LDL刺激的THP-1巨噬细胞的炎症反应,其机制可能包括:mi R-155通过抑制它的靶标分子SOCS1和SIRT1,进而促进STAT3和NF-κB信号途径,使炎症细胞因子及趋化因子增多,单核巨噬细胞迁移增加。3.通过antagomir-155干预mi R-155表达,成功建立了mi R-155表达抑制的Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化模型;mi R-155抑制有利于改善Apo E-/-模型小鼠的动脉粥样硬化炎症和斑块稳定性,其机制可能是部分通过增加其靶标分子SOCS1、SIRT1的表达,进而抑制STAT3和NF-κB途径的活化。
【关键词】：microRNA-155 动脉粥样硬化 炎症 SOCS1 SIRT1
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.4
【目录】：

• 中英文对照索引4-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-15
• 第一章 前言15-17
• 第二章 鉴定THP-1 细胞中炎症相关的miR-155的靶标分子17-41
• 2.1 材料和方法17-30
• 2.2 结果30-39
• 2.3 讨论39-40
• 2.4 小结40-41
• 第三章 miR-155对oxLDL刺激的THP-1巨噬细胞炎症的影响及机制研究41-64
• 3.1 材料和方法41-54
• 3.2 结果54-60
• 3.3 讨论60-63
• 3.4 小结63-64
• 第四章 miR-155对APOE小鼠动脉粥样硬化炎症的影响64-86
• 4.1 材料和方法64-77
• 4.2 结果77-83
• 4.3 讨论83-85
• 4.4 小结85-86
• 全文总结86-87
• 参考文献87-95
• 文献综述一 动脉粥样硬化中的炎症95-108
• 参考文献102-108
• 文献综述二MicroRNA-155作为炎性疾病的治疗靶点108-119
• 参考文献114-119
• 博士就读期间发表论文情况119-120
• 致谢120

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