ATXN3去泛素化调节KLF4促进乳腺癌发生发展的研究
发布时间：2022-01-15 22:36
Kruppel Like Factor 4（KLF4）是锌指转录因子家族KLF中的一员,在多种生物学过程中发挥关键作用。KLF4在肿瘤的发生发展中由于所在组织类型不同而具有抑癌基因和癌基因的双重功能。KLF4在细胞内半衰期很短,其蛋白水平可受多种因素刺激而发生迅速变化,进而造成细胞内生理和病理反应。这些调控大多通过蛋白翻译后修饰介导。近年来,去泛素化也作为调节蛋白水平和功能的一项重要的翻译后修饰机制而被广泛研究,于是我们想要进一步探究去泛素化酶在KLF4蛋白调节中的作用。本实验中,我们在一个含有65个去泛素化酶（Deubiquitinating enzyme,DUB）的文库中筛选出KLF4的首个去泛素化酶。首先我们将候选DUB分别在工具细胞U20S和乳腺癌细胞MCF7中过表达,通过检测细胞内KLF4的含量,筛选出在这两种细胞中均影响KLF4蛋白水平的DUB。而后利用免疫共沉淀技术,分析出通过与KLF4直接相互作用而对其进行调节的DUB。采用以上的筛选策略,我们筛选出ATXN3可能是KLF4的一个去泛素化酶。而后,我们通过半衰期实验和泛素化实验验证了 ATXN3可通过减弱KLF4的泛素化...
【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２－?１去泛素化酶筛选流程图??用文库中的去泛素化酶（ＤＵＢ）表达载体分别稳定、瞬时转染Ｕ２０Ｓ细胞和ＭＣＦ７??细胞
去泛素化酶取交集，获得可能在各类细胞中广泛存在的ＫＬＦ４的去泛素化酶。Ｄ．通??过ＩＰ筛选出能与ＫＬＦ４结合的去泛素化酶。??筛选的流程图见图２－１，其主要策略是关注ＫＬＦ４蛋白水平在各种去泛素化酶??过表达后的变化。我们首先分析了过表达６５种去泛素化酶的Ｕ２０Ｓ细胞和ＭＣＦ７??细胞中ＫＬＦ４的表达水平，筛选出上调Ｕ２０Ｓ细胞中ＫＬＦ４的去泛素化酶。与阴性??对照细胞系相比，我们在１３个去泛素化酶过表达的Ｕ２０Ｓ细胞系中观察到ＫＬＦ４蛋??白水平上调（图２－２?Ａ），这１３个去泛素化酶分别是：ＵＳＰ１４、ＵＳＰ８、ＵＳＰ４８、??ＵＳＰ２２、ＥＩＦ３Ｓ５、ＵＣＨＬ１、ＵＳＰ４６、ＵＳＰ５０、Ｊ０ＳＤ２、ＵＳＰ２０、０ＴＵＤ４、ＡＴＸＮ３、??ＵＣＨＬ５。另外，在ＭＣＦ７细胞中，我们在１３个不同的去泛素化酶过表达时观察到??ＫＬＦ４蛋白水平增加（图２－２?Ｂ），这１３个去泛素化酶分别是：ＡＴＸＮ３、ＢＡＰ１、??ＢＲＣＣ３、Ｃ０ＰＳ６、ＣＹＬＤ、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ３０、０ＴＵＤ５、ＵＳＰ３６、ＵＳＰ４８、??ＵＳＰ５、ＵＳＰ１０。为了得到在不同种细胞中广泛发挥作用的ＫＬＦ４的去泛素化酶，我??们对这两种细胞系的筛选结果取交集，Ｖｅｎｎ图显示ＡＴＸＮ３和ＵＳＰ４８可同时在这??两种细胞中发挥作用（图２－２?Ｃ）。??由于酶与底物的结合依赖于它们的直接相互作用
?结果??了?ＡＴＸＮ３与ＫＬＦ４之间的相互作用（图２－３Ａ．Ｂ）。说明ＡＴＸＮ３可以直接作用于??ＫＬＦ４，从而对其进行调节。??ＷＣＬ?ＩＰ：?Ｆｌａｇ??ＧＦＰ－Ｃｔｒｌ?＋?＋??ＧＦＰ－ＫＬＦ４?＋?＋??Ｆ／Ｈ－ＡＴＸＮ３?＋?＋?＋?＋??ＧＦＰ?５??Ｆｌａｇ?＾■？一?一??图２－?３?ＡＴＸＮ３与ＫＬＦ４相互作用??生长状态良好的ＨＥＫ２９３细胞以３?ｘ?１〇５／孔接种于６孔板。培养过夜使细胞贴壁后，??用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ?２０００转入带ＧＦＰ标签的ＫＬＦ４和带Ｆｌａｇ／ＨＡ标签的ＡＴＸＮ３表达??载体，２４小时后收取细胞，用ＮＰ－４０裂解液提取蛋白，而后用带抗Ｈａｇ抗体的琼??脂糖珠ＩＰ富集蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测富集蛋白中ＧＦＰ的含量。??综上所述，我们证实了去泛素化酶ＡＴＸＮ３是通过与ＫＬＦ４相互作用，改变??Ｕ２０Ｓ和ＭＣＦ７细胞内ＫＬＦ４含量。由此我们初步筛选出ＡＴＸＮ３可能为ＫＬＦ４的去??泛素化酶。??２．寻找ＡＴＸＮ３与ＫＬＦ４相互作用的区域??２．１．?ＡＴＸＮ３分子上与ＫＬＦ４结合的区域??ＡＴＸＮ３是去泛素化酶家族ＭＪＤ中的一员。ＭＪＤ家族的全称为Ｍａｃｈａｄｏ??ＪｏｓｅｐｈｉｎＤｏｍａｉｎＰｒｏｔｅｉｎ，其成员的共有的结构特性是氨基端存在一个由大约１８０个??氨基酸残基构成的Ｊｏｓｅｐｈｉｎ结构域。该结构域呈ａ螺旋结构，是一类半胱氨酸蛋白??酶结构域
【参考文献】：
期刊论文
[1]楔横轧辊剪制坯力的研究[J]. 柳传,束学道,胡斌. 热加工工艺. 2015(11)
[2]Deubiquitinating enzyme regulation of the p53 pathway: A lesson from Otub1[J]. Xiao-Xin Sun,Mu-Shui Dai. World Journal of Biological Chemistry. 2014(02)
本文编号：3591442
【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２－?１去泛素化酶筛选流程图??用文库中的去泛素化酶（ＤＵＢ）表达载体分别稳定、瞬时转染Ｕ２０Ｓ细胞和ＭＣＦ７??细胞
去泛素化酶取交集，获得可能在各类细胞中广泛存在的ＫＬＦ４的去泛素化酶。Ｄ．通??过ＩＰ筛选出能与ＫＬＦ４结合的去泛素化酶。??筛选的流程图见图２－１，其主要策略是关注ＫＬＦ４蛋白水平在各种去泛素化酶??过表达后的变化。我们首先分析了过表达６５种去泛素化酶的Ｕ２０Ｓ细胞和ＭＣＦ７??细胞中ＫＬＦ４的表达水平，筛选出上调Ｕ２０Ｓ细胞中ＫＬＦ４的去泛素化酶。与阴性??对照细胞系相比，我们在１３个去泛素化酶过表达的Ｕ２０Ｓ细胞系中观察到ＫＬＦ４蛋??白水平上调（图２－２?Ａ），这１３个去泛素化酶分别是：ＵＳＰ１４、ＵＳＰ８、ＵＳＰ４８、??ＵＳＰ２２、ＥＩＦ３Ｓ５、ＵＣＨＬ１、ＵＳＰ４６、ＵＳＰ５０、Ｊ０ＳＤ２、ＵＳＰ２０、０ＴＵＤ４、ＡＴＸＮ３、??ＵＣＨＬ５。另外，在ＭＣＦ７细胞中，我们在１３个不同的去泛素化酶过表达时观察到??ＫＬＦ４蛋白水平增加（图２－２?Ｂ），这１３个去泛素化酶分别是：ＡＴＸＮ３、ＢＡＰ１、??ＢＲＣＣ３、Ｃ０ＰＳ６、ＣＹＬＤ、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ３０、０ＴＵＤ５、ＵＳＰ３６、ＵＳＰ４８、??ＵＳＰ５、ＵＳＰ１０。为了得到在不同种细胞中广泛发挥作用的ＫＬＦ４的去泛素化酶，我??们对这两种细胞系的筛选结果取交集，Ｖｅｎｎ图显示ＡＴＸＮ３和ＵＳＰ４８可同时在这??两种细胞中发挥作用（图２－２?Ｃ）。??由于酶与底物的结合依赖于它们的直接相互作用
?结果??了?ＡＴＸＮ３与ＫＬＦ４之间的相互作用（图２－３Ａ．Ｂ）。说明ＡＴＸＮ３可以直接作用于??ＫＬＦ４，从而对其进行调节。??ＷＣＬ?ＩＰ：?Ｆｌａｇ??ＧＦＰ－Ｃｔｒｌ?＋?＋??ＧＦＰ－ＫＬＦ４?＋?＋??Ｆ／Ｈ－ＡＴＸＮ３?＋?＋?＋?＋??ＧＦＰ?５??Ｆｌａｇ?＾■？一?一??图２－?３?ＡＴＸＮ３与ＫＬＦ４相互作用??生长状态良好的ＨＥＫ２９３细胞以３?ｘ?１〇５／孔接种于６孔板。培养过夜使细胞贴壁后，??用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ?２０００转入带ＧＦＰ标签的ＫＬＦ４和带Ｆｌａｇ／ＨＡ标签的ＡＴＸＮ３表达??载体，２４小时后收取细胞，用ＮＰ－４０裂解液提取蛋白，而后用带抗Ｈａｇ抗体的琼??脂糖珠ＩＰ富集蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测富集蛋白中ＧＦＰ的含量。??综上所述，我们证实了去泛素化酶ＡＴＸＮ３是通过与ＫＬＦ４相互作用，改变??Ｕ２０Ｓ和ＭＣＦ７细胞内ＫＬＦ４含量。由此我们初步筛选出ＡＴＸＮ３可能为ＫＬＦ４的去??泛素化酶。??２．寻找ＡＴＸＮ３与ＫＬＦ４相互作用的区域??２．１．?ＡＴＸＮ３分子上与ＫＬＦ４结合的区域??ＡＴＸＮ３是去泛素化酶家族ＭＪＤ中的一员。ＭＪＤ家族的全称为Ｍａｃｈａｄｏ??ＪｏｓｅｐｈｉｎＤｏｍａｉｎＰｒｏｔｅｉｎ，其成员的共有的结构特性是氨基端存在一个由大约１８０个??氨基酸残基构成的Ｊｏｓｅｐｈｉｎ结构域。该结构域呈ａ螺旋结构，是一类半胱氨酸蛋白??酶结构域
【参考文献】：
期刊论文
[1]楔横轧辊剪制坯力的研究[J]. 柳传,束学道,胡斌. 热加工工艺. 2015(11)
[2]Deubiquitinating enzyme regulation of the p53 pathway: A lesson from Otub1[J]. Xiao-Xin Sun,Mu-Shui Dai. World Journal of Biological Chemistry. 2014(02)
本文编号：3591442
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