金黄色葡萄球菌二元信号系统和ABC转运体功能研究

发布时间：2017-05-12 15:21

  本文关键词：金黄色葡萄球菌二元信号系统和ABC转运体功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：金黄色葡萄球菌作为全球范围内的院内及社区感染性疾病发生的主要诱因之一,能够在许多部位引发感染,最常见的感染症状包括蜂窝组织炎、脓疱病及软组织脓肿等。金黄色葡萄球菌作为一种成功的致病菌很大程度上归因于其产生的多种致病因子,如溶血素、蛋白酶类、毒素及免疫调理素等。本论文对金黄色葡萄球菌信号感应调控系统及物质转运代谢进行了研究,内容主要分为以下两个方面：1.金黄色葡萄球菌二元信号系统研究二元信号系统是一种广泛存在于古细菌、真细菌及部分真菌和植物中的信号级联传递系统,能够帮助生物体快速准确应答周边环境中的多种刺激。在金黄色葡萄球菌中,二元信号系统作为一类毒性调控因子在维持细菌存活、侵染宿主以及抵抗抗生素杀伤等方面具有重要作用。目前已知在金黄色葡萄球菌基因组中存在16种二元信号系统,其中大部分的功能被阐释,但仍有少数尚未被系统研究。基于此,我们选取了金黄色葡萄球菌中较少有报道的二元信号系统HptRSA与SAOUHSC_01313-1314作为研究对象。对于HptRSA,我们通过序列比对发现其与大肠杆菌己糖磷酸吸收调控UhpABC具有高度同源性,因此实质上这是一种三组份信号传导系统。我们发现金黄色葡萄球菌HptRSA缺失菌株无法再葡萄糖-6-磷酸作唯一碳源的培养基中正常生长,随后的实时定量PCR结果证实HptRSA能够通过调控己糖磷酸盐转运体UhpT的表达促进金黄色葡萄球菌对外源葡萄糖-6-磷酸的摄取。进一步研究发现,金黄色葡萄球菌中UhpT转运体具有较高底物特异性,不能应答其他多种磷酸糖。HprRSA系统中HptA蛋白能够直接结合葡萄糖-6-磷酸,推断其为葡萄糖-6-磷酸主要的感应蛋白。此外,我们还证明了调控蛋白HptR能直接结合uhpT基因启动子,启动子区域30-bp长度核苷酸序列为HptR识别所必需。对于SAOUHSC 01313-1314的功能研究尚在初步探索阶段,敲除该二元信号系统对于细菌的生长分裂,细胞膜形成等表型并没有显著影响。对于其感应的刺激信号及调控的目标基因则需要将来的进一步实验探索,主要思路是在不同压力条件下检测该二元信号系统缺失菌株基因表达变化。2.金黄色葡萄球菌ABC (ATP-binding cassette)转运体WmrAB的功能研究ABC转运体是一种利用ATP水解能量实现物质转运进出细胞膜的膜转运蛋白质。金黄色葡萄球菌中ABC转运体功能的报道主要集中于少数几种抗生素转运体,许多ABC转运体的功能研究仍是空白。我们初步探索了金黄色葡萄球菌一种功能尚未报道的ABC转运体WmrAB。实验发现WmrAB缺失的菌株呈现明显降低的细胞自溶速率以及对糖肽类抗生素如万古霉素、替考拉宁显著减弱的敏感性,进一步实时定量PCR结果表明敲除株细胞壁合成分解代谢相关基因如aaa、lytRS、ddl、walKR等转录水平出现显著变化,综合效果很有可能使得细胞壁的代谢平衡出现某种紊乱。尽管基因位点分析发现WmrAB与SAOUHSC_01313-1314相邻,然而SAOUHSC_01313-1314敲除株中未检测到wmrAB基因转录水平出现明显变化,另外凝胶迁移阻滞实验更证实了二元信号系统调控蛋白与wmrAB并无直接结合,基本排除了SAOUHSC_01313-1314直接调控WmrAB的可能性。以上研究帮助我们更进一步了解了金黄色葡萄球菌中二元信号系统的调控机制以及ABC转运体涉及的多种生理功能,对于前人的实验结论进行了完善与补充,进一步完善了对金黄色葡萄球菌全局调控网络及转运代谢的认识,能够对于开发与研究抗金黄色葡萄球菌感染药物与治疗这种病原菌引发的多种疾病提供一些新思路。但目前仍有一些问题尚未解决,诸如SAOUSC_01313-1314的感应信号,ABC转运体与其他转录调控因子的关联等方面则需要进一步探索。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 二元信号系统 葡萄糖-6-磷酸 ABC转运体 细胞壁代谢
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.11
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 绪论13-43
• 1.1 金黄色葡萄球菌概述13-24
• 1.1.1 引言13-15
• 1.1.2 金黄色葡萄球菌主要致病因子15-19
• 1.1.3 金黄色葡萄球菌细胞壁与自溶现象19-23
• 1.1.4 金黄色葡萄球菌主要毒性调控因子23-24
• 1.2 二元信号系统概述24-36
• 1.2.1 引言24-25
• 1.2.2 二元信号系统组成及分类25-28
• 1.2.3 几种典型的二元信号系统28-29
• 1.2.4 二元信号系统的信号交联29-30
• 1.2.5 金黄色葡萄球菌中的二元信号系统30-35
• 1.2.6 金黄色葡萄球菌二元信号系统研究现状及未来方向35-36
• 1.3 ATP结合盒式(ABC)转运体概述36-40
• 1.3.1 引言36-37
• 1.3.2 ABC转运体结构和分类37-38
• 1.3.3 ABC转运体功能38-39
• 1.3.4 金黄色葡萄球菌中的ABC转运体39-40
• 1.4 二元信号系统与ABC转运体的关联40-42
• 1.5 该课题研究内容和目的42-43
• 第二章 实验材料及方法43-65
• 2.1 实验材料43-48
• 2.1.1 实验菌株及培养条件43-44
• 2.1.2 所用试剂及培养基44-48
• 2.2 分子克隆操作48-54
• 2.2.1 所用引物48-51
• 2.2.2 所用载体51-52
• 2.2.3 基因片段PCR扩增52
• 2.2.4 基因片段凝胶回收52-53
• 2.2.5 质粒抽提转化53
• 2.2.6 化学转化外源基因进入大肠杆菌53
• 2.2.7 金黄色葡萄球菌基因组抽提53-54
• 2.2.8 金黄色葡萄球菌电转感受态细胞制备54
• 2.2.9 电转化外源质粒进入金黄色葡萄球菌54
• 2.3 金黄色葡萄球菌敲除株获得54-55
• 2.3.1 敲除载体构建54-55
• 2.3.2 敲除菌株的筛选鉴定55
• 2.4 金黄色葡萄球菌回补菌株获得55-56
• 2.5 敲除菌株表型实验56-58
• 2.5.1 生长曲线测定56
• 2.5.2 生物膜形成能力检测56
• 2.5.3 自溶能力检测56-57
• 2.5.4 胞外蛋白酶明胶酶谱实验57
• 2.5.5 纤连蛋白粘附能力检测57-58
• 2.5.6 金黄色葡萄球菌聚集能力检测58
• 2.6 金黄色葡萄球菌总RNA分离纯化58-59
• 2.7 反转录及实时定量PCR59
• 2.7.1 mRNA反转录59
• 2.7.2 cDNA实时定量PCR59
• 2.8 金黄色葡萄球菌表达谱芯片59-60
• 2.9 蛋白质免疫印迹试验60
• 2.10 lacZ报告质粒构建60
• 2.11 报告质粒的序列点突变60-61
• 2.12 基因实相表达水平检测61
• 2.13 蛋白质表达纯化61-62
• 2.13.1 目的蛋白质载体构建及诱导表达61
• 2.13.2 目的蛋白质纯化61-62
• 2.13.3 目的蛋白质浓度测定62
• 2.14 蛋白质与目标探针凝胶阻滞实验(EMSA)62-63
• 2.15 等温滴定微量热试验(ITC)63-64
• 2.16 DNase Ⅰ足迹法实验(DNase Ⅰ footprinting assay)64
• 2.17 统计学分析64-65
• 第三章 实验结果与分析65-89
• 3.1 二元信号系统SAOUHSC_00184-00185研究结果及分析65-73
• 3.1.1 SAOUHSC_00184-00185现有研究背景65-66
• 3.1.2 HptRSA进一步研究结果66-73
• 3.2 SAOUHSC_01313-1314及SAOUHSC_01311-1312初步研究结果73-89
• 3.2.1 基因位点及生物信息学分析73-75
• 3.2.2 基因敲除实验结果75-76
• 3.2.3 初步研究结果76-78
• 3.2.4 SAOUHSC_01313-1314进一步研究进展78-82
• 3.2.5 SAOUHSC_01311-1312进一步研究进展82-86
• 3.2.6 SAOUHSC_01313-1314对WmrAB不具有直接调控作用86-89
• 第四章 讨论89-95
• 4.1 HptRSA系统功能的进一步阐释89-91
• 4.2 二元信号系统SAOUHSC_01313-1314的功能初步探索及解释91-92
• 4.3 ABC转运体WmrAB功能初步探索及解释92
• 4.4 工作总结92-95
• 参考文献95-113
• 致谢113-115
• 在读期间发表的学术论文与其他研究成果115

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