结构特异性核酸酶FEN1在宫颈癌治疗中的作用及其机制研究
发布时间：2022-01-23 18:30
目的:宫颈癌（cervicalcancer）是妇科最常见的恶性肿瘤之一,已经严重威胁到全球女性的健康。目前,使用顺铂结合放疗的治疗方案已经作为治疗宫颈癌的标准方案,尤其是对于局部晚期宫颈癌患者。然而,最初接受顺铂治疗的患者在随后的治疗中往往会产生耐药性。顺铂潜在的肾毒性、耳毒性和高催吐作用也限制了其在特殊人群中的使用。DNA分枝结构特异性内切酶-1（Flapendonuclease1,FEN1）是一种同时包含5’分枝状结构内切酶活性（Flapendonuclease,FEN）、缺口依赖性5’内切酶活性（Gapdependentendonuclease,GEN）及5’外切酶活性（Exonuclease,EXO）的核酸酶,在DNA复制中后随链冈崎片段的成熟过程中及DNA损伤修复过程中起着至关重要的作用。FEN1过表达已在多种癌症中被发现,并且已经证明FEN1抑制剂可以增强肿瘤细胞对化疗药物（使DNA损伤相关的药物）的敏感性。然而,FEN1缺陷或活性抑制是否会对宫颈癌细胞的放疗起到增敏效应尚不清楚。另外,由于FEN1在DNA代谢过程中的起着举足轻重的作用,FEN1完全敲除小鼠模型胚胎致死。因...
【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
FEN1在宫颈癌中过表达，并且通过电离辐射可以进一步诱导其表达上调
结构特异性核酸酶FEN1在宫颈癌治疗中的作用及其机制研究第一部分23图2FEN1抑制剂SC13增强Hela细胞对电离辐射的敏感性A.用SC13（100μM）、电离辐射（5Gy）单独或联合处理Hela细胞，72小时后用CCK-8试剂盒测定细胞数。B.使用不同剂量的电离辐射分别处理对照组和SC13（100μM）处理组的Hela细胞，观察细胞活力。C.用SC13（100μM）、IR（5Gy）单独或联合处理Hela细胞，14天后观察细胞集落的形成能力。D.为C图的定量分析。同时我们还通过克隆形成试验进一步证明了这一假设，克隆形成实验结果表明，FEN1抑制剂SC13可以增强Hela癌细胞对电离辐射的敏感性（p<0.05）（图2C，2D），使用FEN1抑制剂SC13联合电离辐射处理Hela细胞，可以明显抑制Hela细胞克隆形成。为了证实这些发现，我们还尝试构建了针对FEN1基因的CRISPR-Cas9敲除质粒，通过脂质体转染的方式转染到Hela细胞中，并加puromycin药进行筛选，然而，经过几次实验均未获得FEN1基因敲除的Hela细胞株。推测原因可能是因为FEN1在Hela细胞中功能互补的基因已经因突变等变异失去了活性，无法替代FEN1在DNA
第一部分结构特异性核酸酶FEN1在宫颈癌治疗中的作用及其机制研究24复制中的功能。于是我们选择了基因突变较少、基因背景较清晰的人源胚肾正常细胞株293T。针对293T进行了FEN1基因敲除细胞系筛选，并通过Westernblot检测验证了FEN1确实在很大程度上表达下调，但未完全敲除（图3A，3B）。后续我们利用FEN1敲低细胞进行了集落形成试验并用电离辐射处理。结果显示，随着电离辐射剂量的增加，293T细胞的克隆形成越来越少，并且FEN1敲低的293T细胞比对照组细胞克隆形成减少更明显。这表明FEN1敲低的细胞比对照组细胞对电离辐射治疗更为敏感（p<0.05）（图3C，3D）。图3FEN1敲低可以增强293T细胞对电离辐射的敏感性A.针对FEN1基因的gRNA序列。B.Westernblot检测293T细胞中FEN1基因敲除效率。C/D.对照组和FEN1基因敲除组经电离辐射处理后293T细胞集落的形成情况展示。3FEN1抑制剂可促进电离辐射诱导的Hela细胞凋亡放疗会导致癌细胞基因组不稳定和凋亡。为了确定FEN1抑制剂SC13是否对电离辐射诱导的Hela细胞凋亡有促进作用，我们进行了Hela细胞凋亡实验。使用Annexin
本文编号：3604935
【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
FEN1在宫颈癌中过表达，并且通过电离辐射可以进一步诱导其表达上调
结构特异性核酸酶FEN1在宫颈癌治疗中的作用及其机制研究第一部分23图2FEN1抑制剂SC13增强Hela细胞对电离辐射的敏感性A.用SC13（100μM）、电离辐射（5Gy）单独或联合处理Hela细胞，72小时后用CCK-8试剂盒测定细胞数。B.使用不同剂量的电离辐射分别处理对照组和SC13（100μM）处理组的Hela细胞，观察细胞活力。C.用SC13（100μM）、IR（5Gy）单独或联合处理Hela细胞，14天后观察细胞集落的形成能力。D.为C图的定量分析。同时我们还通过克隆形成试验进一步证明了这一假设，克隆形成实验结果表明，FEN1抑制剂SC13可以增强Hela癌细胞对电离辐射的敏感性（p<0.05）（图2C，2D），使用FEN1抑制剂SC13联合电离辐射处理Hela细胞，可以明显抑制Hela细胞克隆形成。为了证实这些发现，我们还尝试构建了针对FEN1基因的CRISPR-Cas9敲除质粒，通过脂质体转染的方式转染到Hela细胞中，并加puromycin药进行筛选，然而，经过几次实验均未获得FEN1基因敲除的Hela细胞株。推测原因可能是因为FEN1在Hela细胞中功能互补的基因已经因突变等变异失去了活性，无法替代FEN1在DNA
第一部分结构特异性核酸酶FEN1在宫颈癌治疗中的作用及其机制研究24复制中的功能。于是我们选择了基因突变较少、基因背景较清晰的人源胚肾正常细胞株293T。针对293T进行了FEN1基因敲除细胞系筛选，并通过Westernblot检测验证了FEN1确实在很大程度上表达下调，但未完全敲除（图3A，3B）。后续我们利用FEN1敲低细胞进行了集落形成试验并用电离辐射处理。结果显示，随着电离辐射剂量的增加，293T细胞的克隆形成越来越少，并且FEN1敲低的293T细胞比对照组细胞克隆形成减少更明显。这表明FEN1敲低的细胞比对照组细胞对电离辐射治疗更为敏感（p<0.05）（图3C，3D）。图3FEN1敲低可以增强293T细胞对电离辐射的敏感性A.针对FEN1基因的gRNA序列。B.Westernblot检测293T细胞中FEN1基因敲除效率。C/D.对照组和FEN1基因敲除组经电离辐射处理后293T细胞集落的形成情况展示。3FEN1抑制剂可促进电离辐射诱导的Hela细胞凋亡放疗会导致癌细胞基因组不稳定和凋亡。为了确定FEN1抑制剂SC13是否对电离辐射诱导的Hela细胞凋亡有促进作用，我们进行了Hela细胞凋亡实验。使用Annexin
本文编号：3604935
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