肿瘤分泌型GRP78对巨噬细胞的招募作用以及黄连素干预机制的研究
发布时间：2022-02-20 09:41
葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是内质网中保守的分子伴侣,能够帮助新生蛋白质正确折叠和组装,而且也是一种重要的钙调蛋白,能够结合Ca2+,调节钙稳态。研究表明,肿瘤缺氧、缺糖、酸性的微环境会刺激GRP78发生高表达。高表达的GRP78会由内质网逃逸到线粒体、细胞核、细胞质和细胞膜表面等促进肿瘤进程。更重要的是,GRP78可以被分泌到胞外,通过改造微环境促进肿瘤发展。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境中数目最多的一类免疫细胞,TAMs能够分泌细胞因子、趋化因子等为肿瘤的生长和存活提供有利条件,而分泌型GRP78能够通过调节肿瘤微环境中多种间质细胞,改造微环境,促进肿瘤发展,表明二者在微环境中发挥“促肿瘤”的功能上具有相似之处;TAMs受各种趋化因子、细胞因子等的招募常常聚集于肿瘤的缺氧部位,而肿瘤组织中心缺氧的微环境会导致细胞内GRP78的高表达,表明二者在定位上有相似之处;TAMs大量出现在肿瘤发展的中后期,而GRP78的表达也与肿瘤的恶性程度呈正相关,因此二者在出现的时间上也具有一定的相似之处。基于上述GRP78与巨噬细胞在功能、定位和出现的时间上的相似之...
【文章来源】：山西大学山西省
【文章页数】：164 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1 引言
2 肿瘤微环境与肿瘤相关巨噬细胞
2.1 肿瘤微环境的提出及其组成
2.2 肿瘤相关巨噬细胞的起源
2.3 肿瘤相关巨噬细胞在微环境中的作用
2.3.1 TAMs在血管生成中的作用
2.3.2 TAMs在淋巴管生成中的作用
2.3.3 TAMs在免疫抑制中的作用
2.3.4 TAMs在胞外基质重塑中的作用
2.3.5 TAMs在促进肿瘤细胞侵袭和转移中的作用
2.4 TAMs浸润到肿瘤组织的诱导因素
2.4.1 趋化因子、细胞因子、生长因子的刺激
2.4.2 低氧的刺激
2.5 细胞定向迁移的分子机制
2.5.1 钙信号
2.5.2 骨架重塑与Rho家族成员的调控机制
3 GRP78 与肿瘤
3.1 GRP78 的基本结构和功能
3.2 肿瘤分泌型GRP78 的功能
3.3 分泌型蛋白质进入真核细胞的途径
3.3.1 吞噬作用(Phagocytosis)
3.3.2 胞饮作用(Pinocytosis)
4 靶向GRP78 的肿瘤干预策略
5 本课题的研究意义及研究内容
第二章 分泌型GRP78 能够招募巨噬细胞到肿瘤组织
1 引言
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂、材料及仪器设备
2.1.1 试剂及抗体
2.1.2 质粒、菌株和细胞系
2.1.3 小鼠和病人血液样品
2.1.4 明胶酶谱实验相关试剂的配制
2.1.5 仪器设备
2.2 细胞培养及肿瘤细胞/巨噬细胞条件培养基的收集
2.2.1 细胞培养
2.2.2 细胞传代
2.2.3 细胞冻存
2.2.4 细胞复苏
2.2.5 肿瘤细胞/巨噬细胞条件培养基的收集
2.3 ELISA检测
2.4 pET-28a-GRP78 质粒构建、蛋白表达纯化、内毒素的去除
2.4.1 pET-28a-GRP78 质粒构建
2.4.2 His-GRP78 蛋白的诱导表达
2.4.3 His-GRP78 蛋白的纯化
2.4.4 His-GRP78 蛋白内毒素的去除
2.5 细胞迁移实验
2.5.1 细胞Transwell实验
2.5.2 细胞划痕实验
2.5.3 体外RAW264.7 细胞定向迁移实验
2.6 细胞与基质之间的粘附实验
2.7 巨噬细胞浸润的体内实验
2.7.1 裸鼠荷瘤模型
2.7.2 基质胶模型
2.8 Western blot实验
2.9 明胶酶谱实验
2.10 实时荧光定量PCR实验
2.10.1 细胞总RNA的提取
2.10.2 细胞总RNA的反转录
2.10.3 实时荧光定量PCR
2.11 免疫荧光染色
2.12 数据统计与分析
3 实验结果
3.1 GRP78 的分泌量和肿瘤恶性程度呈正相关
3.2 GRP78 的分泌量与肿瘤的促巨噬细胞迁移能力呈正相关
3.3 肿瘤分泌型GRP78 诱导巨噬细胞迁移
3.4 肿瘤分泌型GRP78 能够在体外招募RAW264.7 细胞
3.5 分泌型GRP78 在体内能够招募巨噬细胞
3.6 Fibronectin-integrin-β1-FAK信号介导了分泌型GRP78 在巨噬细胞与基质之间的促粘附作用
3.7 分泌型GRP78 促进了巨噬细胞胞外基质的降解
4 讨论
5 小结
第三章 分泌型GRP78 通过多种胞吞方式的协同作用进入巨噬细胞
1 引言
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂及材料
2.1.1 试剂及抗体
2.1.2 细胞系和质粒
2.1.3 试剂配方
2.2 细胞培养
2.3 His-GRP78 蛋白的诱导表达纯化与FITC-/Biotin-标记
2.4 His-GRP78 蛋白的内化实验
2.4.1 抗体检测His-GRP78 的内化情况
2.4.2 荧光标记His-GRP78 检测其内化情况
2.4.3 能量缺失情况下检测His-GRP78 蛋白内化情况
2.4.4 M期阻滞情况下检测His-GRP78 蛋白内化情况
2.4.5 使用内吞抑制剂检测His-GRP78 蛋白内化情况
2.5 质谱鉴定分泌型GRP78 的受体
2.6 siRNA转染
2.7 Western blot和免疫共沉淀(Co-IP)
2.8 免疫荧光染色
2.9 数据统计与分析
3 实验结果
3.1 His-GRP78 能够进入RAW264.7 细胞
3.2 His-GRP78 能够通过胞吞作用进入RAW264.7 细胞
3.3 吞噬作用有助于分泌型GRP78 进入巨噬细胞
3.4 分泌型GRP78 的内化依赖于巨胞饮作用
3.5 网格蛋白和窖蛋白介导的胞吞作用可能也是分泌型GRP78 进入巨噬细胞的途径
3.6 Clathrin和 Caveolin-1 介导的胞吞作用是分泌型GRP78 进入巨噬细胞的重要途径
3.7 Ajuba受体介导了分泌型GRP78 的内化作用
3.8 内化的GRP78 定位于巨噬细胞的内质网和线粒体
4 讨论
5 小结
第四章 分泌型GRP78 能够通过与Ca~(2+)结合促进巨噬细胞的骨架重塑
1 引言
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂及材料
2.1.1 试剂及抗体
2.1.2 细胞系
2.2 细胞培养
2.3 F-actin检测
2.3.1 Western blot检测法
2.3.2 荧光标记法
2.3.3 荧光显微镜下检测法
2.4 活性形式的RhoA,Rac1和Cdc42 蛋白的检测
2.5 Western blot实验
2.6 荧光定量PCR实验
2.6.1 细胞总RNA的提取、总RNA的反转录及实时荧光定量PCR
2.6.2 miRNA的反转录及实时荧光定量PCR
2.6.3 miRNA抑制剂的转染
2.7 免疫荧光染色
2.8 RAW264.7 细胞Ca~(2+)变化的检测
2.9 数据统计与分析
3 实验结果
3.1 分泌型GRP78 能够和胞内Ca~(2+)结合并促进巨噬细胞产生极性
3.2 巨噬细胞的极性引起其骨架重塑
3.3 RhoGDIA介导了GRP78 在促进细胞骨架重塑中的作用
3.4 miR-200b-3p能够直接靶向RhoGDIA
3.5 miR-200b-3p/RhoGDIA信号在GRP78 诱导的巨噬细胞迁移过程中发挥了重要作用
4 讨论
5 小结
第五章 黄连素抑制GRP78 分泌的分子机制
1 引言
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂及材料
2.1.1 试剂及抗体
2.1.2 质粒和细胞系
2.2 细胞培养
2.3 质粒转染
2.4 His-GRP78 蛋白的诱导表达和纯化
2.5 外泌体的提取实验
2.6 黄连素与GRP78 相互作用的确定
2.6.1 利用游离 berberine 的竞争性结合实验,验证berberine与GRP78的相互作用
2.6.2 利用荧光光谱技术检测berberine与 GRP78 的相互作用
2.6.3 鉴定与berberine发生相互作用的GRP78 结构域
2.7 Western blot实验
2.8 数据统计与分析
3 实验结果
3.1 黄连素抑制了HCT-116和DLD1 细胞中GRP78 的分泌
3.2 黄连素和GRP78 存在相互作用
3.3 黄连素能够与GRP78的ATP酶结构域直接结合
3.4 黄连素通过抑制ATP酶活性调节GRP78 的构象
4 讨论
5 小结
第六章 高浓度黄连素通过提高胞内GRP78 水平诱导肿瘤细胞自噬性的死亡
1 引言
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂及材料
2.1.1 试剂及抗体
2.1.2 细胞系和质粒
2.2 细胞培养
2.3 siRNA细胞转染
2.4 MTT实验
2.5 透射电子显微镜(TEM)下观察自噬小体的变化
2.6 蛋白质稳定性、Western blot以及Co-IP实验
2.7 免疫荧光染色
2.8 数据统计与分析
3 实验结果
3.1 黄连素能够诱导HCT-116、DLD1和HepG2 细胞发生自噬性的死亡
3.2 黄连素诱导了HCT-116 细胞发生自噬
3.3 自噬抑制剂阻断了黄连素诱导HCT-116 细胞自噬的发生
3.4 黄连素诱导DLD1和HepG2 细胞发生了自噬
3.5 黄连素能够诱导肿瘤细胞内GRP78 的高表达
3.6 GRP78 在黄连素诱导的肿瘤细胞自噬过程中发挥着重要作用
3.7 黄连素通过提高ATF6 的水平促进了GRP78 的表达
3.8 黄连素提高了GRP78 蛋白的稳定性
3.9 黄连素促进了GRP78与VPS34 的结合
4 讨论
5 小结
总结与展望
参考文献
缩略词表
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简况及联系方式
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于1H NMR代谢组学技术探究GRP78蛋白对巨噬细胞极化的干预效应[J]. 张立超,李爱平,剌晓琴,李卓玉. 山西大学学报(自然科学版). 2017(01)
[2]Hematopoietic stem cell-derived adipocytes and fibroblasts in the tumor microenvironment[J]. Ying Xiong,Lindsay T Mc Donald,Dayvia L Russell,Ryan R Kelly,Katie R Wilson,Meenal Mehrotra,Adam C Soloff,Amanda C LaRue. World Journal of Stem Cells. 2015(02)
本文编号：3634775
【文章来源】：山西大学山西省
【文章页数】：164 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1 引言
2 肿瘤微环境与肿瘤相关巨噬细胞
2.1 肿瘤微环境的提出及其组成
2.2 肿瘤相关巨噬细胞的起源
2.3 肿瘤相关巨噬细胞在微环境中的作用
2.3.1 TAMs在血管生成中的作用
2.3.2 TAMs在淋巴管生成中的作用
2.3.3 TAMs在免疫抑制中的作用
2.3.4 TAMs在胞外基质重塑中的作用
2.3.5 TAMs在促进肿瘤细胞侵袭和转移中的作用
2.4 TAMs浸润到肿瘤组织的诱导因素
2.4.1 趋化因子、细胞因子、生长因子的刺激
2.4.2 低氧的刺激
2.5 细胞定向迁移的分子机制
2.5.1 钙信号
2.5.2 骨架重塑与Rho家族成员的调控机制
3 GRP78 与肿瘤
3.1 GRP78 的基本结构和功能
3.2 肿瘤分泌型GRP78 的功能
3.3 分泌型蛋白质进入真核细胞的途径
3.3.1 吞噬作用(Phagocytosis)
3.3.2 胞饮作用(Pinocytosis)
4 靶向GRP78 的肿瘤干预策略
5 本课题的研究意义及研究内容
第二章 分泌型GRP78 能够招募巨噬细胞到肿瘤组织
1 引言
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂、材料及仪器设备
2.1.1 试剂及抗体
2.1.2 质粒、菌株和细胞系
2.1.3 小鼠和病人血液样品
2.1.4 明胶酶谱实验相关试剂的配制
2.1.5 仪器设备
2.2 细胞培养及肿瘤细胞/巨噬细胞条件培养基的收集
2.2.1 细胞培养
2.2.2 细胞传代
2.2.3 细胞冻存
2.2.4 细胞复苏
2.2.5 肿瘤细胞/巨噬细胞条件培养基的收集
2.3 ELISA检测
2.4 pET-28a-GRP78 质粒构建、蛋白表达纯化、内毒素的去除
2.4.1 pET-28a-GRP78 质粒构建
2.4.2 His-GRP78 蛋白的诱导表达
2.4.3 His-GRP78 蛋白的纯化
2.4.4 His-GRP78 蛋白内毒素的去除
2.5 细胞迁移实验
2.5.1 细胞Transwell实验
2.5.2 细胞划痕实验
2.5.3 体外RAW264.7 细胞定向迁移实验
2.6 细胞与基质之间的粘附实验
2.7 巨噬细胞浸润的体内实验
2.7.1 裸鼠荷瘤模型
2.7.2 基质胶模型
2.8 Western blot实验
2.9 明胶酶谱实验
2.10 实时荧光定量PCR实验
2.10.1 细胞总RNA的提取
2.10.2 细胞总RNA的反转录
2.10.3 实时荧光定量PCR
2.11 免疫荧光染色
2.12 数据统计与分析
3 实验结果
3.1 GRP78 的分泌量和肿瘤恶性程度呈正相关
3.2 GRP78 的分泌量与肿瘤的促巨噬细胞迁移能力呈正相关
3.3 肿瘤分泌型GRP78 诱导巨噬细胞迁移
3.4 肿瘤分泌型GRP78 能够在体外招募RAW264.7 细胞
3.5 分泌型GRP78 在体内能够招募巨噬细胞
3.6 Fibronectin-integrin-β1-FAK信号介导了分泌型GRP78 在巨噬细胞与基质之间的促粘附作用
3.7 分泌型GRP78 促进了巨噬细胞胞外基质的降解
4 讨论
5 小结
第三章 分泌型GRP78 通过多种胞吞方式的协同作用进入巨噬细胞
1 引言
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂及材料
2.1.1 试剂及抗体
2.1.2 细胞系和质粒
2.1.3 试剂配方
2.2 细胞培养
2.3 His-GRP78 蛋白的诱导表达纯化与FITC-/Biotin-标记
2.4 His-GRP78 蛋白的内化实验
2.4.1 抗体检测His-GRP78 的内化情况
2.4.2 荧光标记His-GRP78 检测其内化情况
2.4.3 能量缺失情况下检测His-GRP78 蛋白内化情况
2.4.4 M期阻滞情况下检测His-GRP78 蛋白内化情况
2.4.5 使用内吞抑制剂检测His-GRP78 蛋白内化情况
2.5 质谱鉴定分泌型GRP78 的受体
2.6 siRNA转染
2.7 Western blot和免疫共沉淀(Co-IP)
2.8 免疫荧光染色
2.9 数据统计与分析
3 实验结果
3.1 His-GRP78 能够进入RAW264.7 细胞
3.2 His-GRP78 能够通过胞吞作用进入RAW264.7 细胞
3.3 吞噬作用有助于分泌型GRP78 进入巨噬细胞
3.4 分泌型GRP78 的内化依赖于巨胞饮作用
3.5 网格蛋白和窖蛋白介导的胞吞作用可能也是分泌型GRP78 进入巨噬细胞的途径
3.6 Clathrin和 Caveolin-1 介导的胞吞作用是分泌型GRP78 进入巨噬细胞的重要途径
3.7 Ajuba受体介导了分泌型GRP78 的内化作用
3.8 内化的GRP78 定位于巨噬细胞的内质网和线粒体
4 讨论
5 小结
第四章 分泌型GRP78 能够通过与Ca~(2+)结合促进巨噬细胞的骨架重塑
1 引言
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂及材料
2.1.1 试剂及抗体
2.1.2 细胞系
2.2 细胞培养
2.3 F-actin检测
2.3.1 Western blot检测法
2.3.2 荧光标记法
2.3.3 荧光显微镜下检测法
2.4 活性形式的RhoA,Rac1和Cdc42 蛋白的检测
2.5 Western blot实验
2.6 荧光定量PCR实验
2.6.1 细胞总RNA的提取、总RNA的反转录及实时荧光定量PCR
2.6.2 miRNA的反转录及实时荧光定量PCR
2.6.3 miRNA抑制剂的转染
2.7 免疫荧光染色
2.8 RAW264.7 细胞Ca~(2+)变化的检测
2.9 数据统计与分析
3 实验结果
3.1 分泌型GRP78 能够和胞内Ca~(2+)结合并促进巨噬细胞产生极性
3.2 巨噬细胞的极性引起其骨架重塑
3.3 RhoGDIA介导了GRP78 在促进细胞骨架重塑中的作用
3.4 miR-200b-3p能够直接靶向RhoGDIA
3.5 miR-200b-3p/RhoGDIA信号在GRP78 诱导的巨噬细胞迁移过程中发挥了重要作用
4 讨论
5 小结
第五章 黄连素抑制GRP78 分泌的分子机制
1 引言
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂及材料
2.1.1 试剂及抗体
2.1.2 质粒和细胞系
2.2 细胞培养
2.3 质粒转染
2.4 His-GRP78 蛋白的诱导表达和纯化
2.5 外泌体的提取实验
2.6 黄连素与GRP78 相互作用的确定
2.6.1 利用游离 berberine 的竞争性结合实验,验证berberine与GRP78的相互作用
2.6.2 利用荧光光谱技术检测berberine与 GRP78 的相互作用
2.6.3 鉴定与berberine发生相互作用的GRP78 结构域
2.7 Western blot实验
2.8 数据统计与分析
3 实验结果
3.1 黄连素抑制了HCT-116和DLD1 细胞中GRP78 的分泌
3.2 黄连素和GRP78 存在相互作用
3.3 黄连素能够与GRP78的ATP酶结构域直接结合
3.4 黄连素通过抑制ATP酶活性调节GRP78 的构象
4 讨论
5 小结
第六章 高浓度黄连素通过提高胞内GRP78 水平诱导肿瘤细胞自噬性的死亡
1 引言
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂及材料
2.1.1 试剂及抗体
2.1.2 细胞系和质粒
2.2 细胞培养
2.3 siRNA细胞转染
2.4 MTT实验
2.5 透射电子显微镜(TEM)下观察自噬小体的变化
2.6 蛋白质稳定性、Western blot以及Co-IP实验
2.7 免疫荧光染色
2.8 数据统计与分析
3 实验结果
3.1 黄连素能够诱导HCT-116、DLD1和HepG2 细胞发生自噬性的死亡
3.2 黄连素诱导了HCT-116 细胞发生自噬
3.3 自噬抑制剂阻断了黄连素诱导HCT-116 细胞自噬的发生
3.4 黄连素诱导DLD1和HepG2 细胞发生了自噬
3.5 黄连素能够诱导肿瘤细胞内GRP78 的高表达
3.6 GRP78 在黄连素诱导的肿瘤细胞自噬过程中发挥着重要作用
3.7 黄连素通过提高ATF6 的水平促进了GRP78 的表达
3.8 黄连素提高了GRP78 蛋白的稳定性
3.9 黄连素促进了GRP78与VPS34 的结合
4 讨论
5 小结
总结与展望
参考文献
缩略词表
攻读学位期间取得的研究成果
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个人简况及联系方式
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于1H NMR代谢组学技术探究GRP78蛋白对巨噬细胞极化的干预效应[J]. 张立超,李爱平,剌晓琴,李卓玉. 山西大学学报(自然科学版). 2017(01)
[2]Hematopoietic stem cell-derived adipocytes and fibroblasts in the tumor microenvironment[J]. Ying Xiong,Lindsay T Mc Donald,Dayvia L Russell,Ryan R Kelly,Katie R Wilson,Meenal Mehrotra,Adam C Soloff,Amanda C LaRue. World Journal of Stem Cells. 2015(02)
本文编号：3634775
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/3634775.html
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