抗甲肝病毒药物筛选体系建立及病毒蛋白pX的功能研究

发布时间：2022-07-11 10:13

　　甲型肝炎病毒（hepatitis A virus,HAV）感染是诱发肝炎的主要原因之一,严重时会引起肝衰竭。目前,临床上仍缺乏有效的直接抗病毒药物。HAV在过去被认为以无膜裸露病毒颗粒的形式存在,但最近的研究发现它通过劫持宿主细胞的内体分选复合物（endosomal sorting complexes required for transport,ESCRT）而形成有膜包被的eHAV（enveloped-HAV）。与裸露病毒颗粒相比,eHAV特异存在一种病毒结构蛋白pX。然而,HAV如何从宿主获得膜的细节过程仍不清楚,pX在其中的功能尚无相关研究。首先,我们开发了一种名为Huh-7.5.1-GA的基于荧光实时报告HAV感染的检测系统。该体系通过监测绿色荧光蛋白（GFP）从细胞质转移到细胞核的现象可视化HAV感染,并且被验证可用于抗病毒药物的筛选。例如,IFN-α可以有效阻止HAV持续感染的细胞中的GFP转移。利用该报告体系,我们发现一种FDA批准的用于治疗慢性丙型肝炎的药物sofosbuvir可有效抑制HAV感染。另一方面,我们发现病毒蛋白pX在eHAV形成过程中是必需的,且其N-末端... 

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【学位级别】：博士

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摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 甲型肝炎病毒简介
        1.1.1 分子病毒学
        1.1.2 病毒生活史
            1.1.2.1 病毒入侵
            1.1.2.2 病毒蛋白翻译
            1.1.2.3 病毒基因组RNA的合成
            1.1.2.4 病毒组装和释放
        1.1.3 病毒的细胞培养体系
        1.1.4 病毒感染性的滴定
        1.1.5 流行病学
        1.1.6 天然免疫反应与HAV感染
    1.2 细胞外囊泡以及与eHAV释放的关系
        1.2.1 细胞外囊泡
        1.2.2 eHAV释放与exosome的关系
    1.3 HAV结构蛋白pX的特殊性
第2章 材料与方法
    2.1 质粒与试剂
    2.2 细胞培养
    2.3 病毒的生产与感染
        2.3.1 慢病毒的包装与生产
        2.3.2 HAV病毒的生产
    2.4 HAV感染的可视化检测体系
    2.5 HAV感染性滴定
    2.6 shRNA介导的基因敲低
    2.7 密度梯度离心
    2.8 差速离心
    2.9 Western Blotting
    2.10 细胞总RNA抽提,反转录和荧光定量PCR
    2.11 免疫荧光及活细胞荧光成像技术
    2.12 免疫电镜和结构电镜
    2.13 细胞增殖实验
    2.14 同源氨基酸序列以及NES的比对
    2.15 数据统计学分析
第3章 第一部分研究内容
    3.1 HAV感染的可视化体系的建立和应用
        3.1.1 荧光可视化体系的建立
        3.1.2 荧光可视化体系的应用:筛选HAV的直接抗病毒药物
第4章 第二部分研究内容
    4.1 pX引导融合蛋白eGFPpX进入外泌体样小泡中
        4.1.1 eGFPpX融合蛋白的构建
        4.1.2 eGFPpX以EV形式释放出细胞
        4.1.3 pX诱导eGFPpX进入MVB
        4.1.4 pX与ALIX的相互作用
    4.2 pX对eHAV释放的影响
        4.2.1 pX C-端的截短微弱的抑制总HAV感染性颗粒的释放
        4.2.2 密度梯度分析pX的C-端的截短对eHAV释放的影响
        4.2.3 HAV感染与外泌体释放
        4.2.4 pX C-端一半与ALIX相互作用
    4.3 pX N-端的新型NES的发现
    4.4 NES功能的验证
第5章 讨论
    5.1 用于HAV感染检测的荧光报告体系
    5.2 HAV结构蛋白pX与eHAV获得膜的关系
参考文献
附录
    缩略语
致谢
作者简历
专业综述
    参考文献


【参考文献】：
期刊论文
[1]Molecular evolution of hepatitis A virus in a human diploid cell line[J]. Cai-Hua Tang, Institute of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital, College of Medical Science, Zhejiang University, Hangzhou 310003, Zhejiang Province, China Cai-Hua Tang, Jiang-Sen Mao, Shao-Ai Chai, Yong Chen, Fang-Cheng Zhuang, Zhejiang Academy of Medical Science, Hangzhou 310013, Zhejiang Province, China.  World Journal of Gastroenterology. 2007(34)



本文编号：3657979