遗传性肺动脉高压高通量药物筛选平台的建立

发布时间：2022-07-12 19:33

　　肺动脉高压是一种慢性进行性心血管疾病,通常以肺动脉压力升高、肺血管阻力增加（mPAP≥25mmHg、PAWP≤15mmHg、PVR>3WU）为主要特征,患者通常会因诱发右心衰竭而导致死亡。由于该病发病隐匿、发病初期无特异性症状,通常患者在被确诊时病情已经非常严重。其发病机制非常复杂,目前认为主要的病理学改变有肺血管重构,肺中小动脉壁中层平滑肌细胞增殖加快、内层内皮细胞出现功能损伤、新生内膜形成、内膜纤维化、丛状病变等。遗传性肺动脉高压属于肺动脉高压第一分类。目前发现导致肺动脉高压的突变基因有BMPRⅡ、SMAD9、CAV1、KCNK3,其中BMPRⅡ突变所占比例最高,有70%～80%的家族性肺动脉高压均有BMPRⅡ突变。即使在特发性肺动脉高压患者中也有20%～40%的患者有BMPRⅡ突变。部分没有BMPRⅡ突变的病情严重的肺动脉高压患者也被发现出现BMPRⅡ表达量下降的情况。相比没有BMPRⅡ突变的患者,BMPRⅡ突变患者具有发病时间更早,病情更严重的特点。尽管近十年我国已引入一系列药物用于肺动脉高压的治疗,患者5年生存率有所提高,但是远期生存率仍然很低,而且目前临床应用的治疗药... 

【文章页数】：120 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
前言
    1.1. 选题的目的和意义
    1.2. BMPRⅡ信号通路与肺动脉高压的关系
    1.3. 血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的功能
    1.4. 目前的肺动脉高压的药物治疗
    1.5. 药物筛选方法
        1.5.1. 传统药物筛选方法
        1.5.2. 高通量药物筛选
        1.5.3. 基于基因表达谱的筛选方法
        1.5.4. HTS~2高通量筛选方法
第一章 建立遗传性肺动脉高压细胞模型
    1.1. 材料
        1.1.1. 主要试剂和耗材
        1.1.2. 主要仪器设备
        1.1.3. 细胞来源
        1.1.4. 载体信息
    1.2. 方法
        1.2.1. 细胞培养
        1.2.2. 感受态细胞制备和转化
        1.2.3. 摇菌和菌液保存
        1.2.4. 质粒提取
        1.2.5. 慢病毒包装
        1.2.6. 嘌呤霉素最佳杀灭浓度测定
        1.2.7. 慢病毒感染原代细胞
        1.2.8. Trizol法提取细胞RNA
        1.2.9. RT-qPCR
        1.2.10. 免疫印迹
        1.2.11. MTS检测细胞增殖能力
        1.2.12. RNA-seq建库
        1.2.13. Qubit检测测序样本浓度
        1.2.14. 测序数据处理和统计分析
    1.3. 结果
        1.3.1. 慢病毒感染的人肺动脉平滑肌细胞BMPRⅡ表达变化
        1.3.2. BMPRⅡ敲低对人肺动脉平滑肌细胞增殖能力的影响
        1.3.3. BMPRⅡ敲低的人肺动脉平滑肌细胞转录组水平的变化
        1.3.4. 慢病毒感染的人肺动脉内皮细胞BMPRⅡ表达变化
        1.3.5. BMPRⅡ敲低的人肺动脉内皮细胞形态观察
        1.3.6. BMPRⅡ敲低的人肺动脉内皮细胞αSMA表达量变化
        1.3.7. BMPRⅡ敲低的人肺动脉内皮细胞转录组水平的改变
    1.4. 本章讨论
    1.5. 本章小结
第二章 建立遗传性肺动脉高压药物筛选体系
    2.1. 材料
        2.1.1. 主要试剂和耗材
        2.1.2. 主要仪器设备
        2.1.3. 实验溶液配制
        2.1.4. 筛选细胞来源
    2.2. 方法
        2.2.1. 探针磷酸化和回收
        2.2.2. 筛选细胞处理
        2.2.3. 药物处理方式
        2.2.4. RASL-seq建库
        2.2.5. 琼脂糖凝胶电泳
        2.2.6. 琼脂糖凝胶回收
        2.2.7. Qubit检测测序样本浓度
        2.2.8. 测序数据处理和统计分析
    2.3. 结果
        2.3.1. 基因表达谱的确定
        2.3.2. 样本重复性检测
        2.3.3. 化合物筛选结果分析
        2.3.4. 6H05对BMPRⅡ敲低的人肺动脉内皮细胞的作用
    2.4. 本章讨论
    2.5. 本章小结
全文总结
参考文献
综述
    参考文献
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]第六届世界肺高血压会议:聚焦肺高血压定义与诊断分类更新[J]. 徐希奇,荆志成.  协和医学杂志. 2018(03)



本文编号：3659716