类泛素蛋白FAT10激活自噬导致肝癌细胞索拉非尼耐药的机制研究

发布时间：2022-12-06 01:39

　　研究背景和目的:多靶点、多激酶抑制剂索拉非尼是第一个被FDA批准用于晚期肝癌患者治疗的靶向药物,但是索拉非尼耐药是导致晚期肝癌患者预后不良的主要原因。自噬（autophagy）是不同于凋亡的一种细胞死亡编程,大量的研究证实细胞自噬的发生与肿瘤的药物敏感性密切相关。最近大量的研究证实蛋白质翻译后修饰是调节蛋白质生物学功能的关键步骤,是蛋白质动态平衡和相互作用的重要分子基础,几乎参与了细胞所有的生理活动过程。类泛素蛋白FAT10（Human HLA-F adjacent transcript 10）目前认为是蛋白质翻译后修饰过程中最重要的蛋白之一。研究表明FAT10在多种恶性肿瘤的的发生发展中起关键的作用,我们前期大量的研究证实FAT10在肝癌组织中呈现高表达,降低FAT10的表达可以显著抑制肝癌的增殖和侵袭转移,然而FAT10和自噬在肝癌索拉非尼耐药中的关系以及FAT10与自噬的关系尚不清楚。本研究拟先通过构建索拉非尼耐药的肝癌细胞株观察FAT10对索拉非尼耐药的关系;其次通过体内和体外实验明确FAT10是否调控自噬进而影响肝癌的索拉非尼耐药;最后探索FAT10调控自噬的具体分子生物学机... 

【文章页数】：104 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
中英文缩略词表
前言
第1章 FAT10 对肝癌细胞索拉非尼耐药的影响
    1 引言
    2 材料
        2.1 细胞系
        2.2 主要试剂
        2.3 自配试剂
        2.4 主要仪器设备
    3 实验方法
        3.1 细胞培养
        3.2 提取细胞总RNA及荧光定量PCR
        3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡实验
        3.4 动物实验
        3.5 组织免疫荧光
        3.6 免疫组化
        3.7 细胞蛋白提取及蛋白免疫印迹反应(Western blot)
        3.8 统计学分析
    4 结果
        4.1 构建索拉非尼耐药的肝癌细胞株
        4.2 观察索拉非尼耐药的肝癌细胞株中FAT10 表达的变化
        4.3 体外实验观察降低FAT10 对肝癌细胞索拉非尼敏感性的影响
        4.4 体内实验观察FAT10 对肝癌细胞索拉非尼耐药的影响
    5 结论
    6 讨论
第2章 FAT10 通过PTEN/AKT信号通路调控自噬影响肝癌细胞索拉非尼敏感性
    1 引言
    第1节 FAT10 通过调控自噬影响肝癌细胞索拉非尼敏感性
        2 材料
            2.1 细胞系
            2.2 主要试剂
            2.3 自配试剂
            2.4 主要仪器设备
        3 实验方法
            3.1 稳转细胞株构建
            3.2 细胞免疫荧光
            3.3 免疫组化
            3.4 蛋白免疫印迹反应(Western blot)
            3.5 统计学分析
        4 结果
            4.1 索拉非尼耐药的肝癌细胞自噬水平的变化
            4.2 体外实验观察降低FAT10 观察索拉非尼耐药肝癌细胞自噬水平的变化
            4.3 体内实验观察降低FAT10 观察索拉非尼耐药肝癌细胞自噬水平的变化
            4.4 FAT10 通过调控索拉非尼耐药细胞自噬水平影响索拉非尼耐药性
        5 结论
    第2节 FAT10 通过PTEN/AKT信号通路调控自噬
        2 材料
            2.1 细胞系
            2.2 主要试剂
            2.3 自配试剂
            2.4 主要仪器设备
        3 实验方法
            3.1 细胞培养
            3.2 蛋白免疫印迹反应(Western blot)
            3.3 细胞免疫荧光
            3.4 统计分析
        4 结果
            4.1 索拉非尼耐药的肝癌细胞自噬相关信号通路PTEN/AKT的变化
            4.2 在索拉非尼耐药的肝癌细胞中FAT10 调控PTEN/AKT信号通路
            4.3 PTEN/AKT信号通路是FAT10 激活自噬的关键信号通路
        5 结论
        6 讨论
第3章 FAT10 通过稳定NEDD4 激活PTEN/AKT信号通路促进自噬导致肝癌细胞索拉非尼耐药
    1 引言
    第1节 FAT10 通过NEDD4 激活PTEN/AKT信号通路
        2 材料
            2.1 细胞系
            2.2 主要试剂
            2.3 自配试剂
            2.4 主要仪器设备
        3 实验方法
            3.1 细胞培养
            3.2 蛋白免疫印迹反应(Western blot)
            3.3 细胞免疫荧光
            3.4 免疫共沉淀(Co-IP)
        4 结果
            4.1 FAT10 蛋白与PTEN蛋白不存在结合
            4.2 FAT10 蛋白与NEDD4 蛋白存在结合
            4.3 FAT10 通过NEDD4 调控PTEN/AKT信号通路进而激活自噬
            4.4 NEDD4是FAT10 调控PTEN/AKT信号通路的关键蛋白
        5 结论
    第2节 FAT10 通过稳定NEDD4 的表达进而促进PTEN泛素化降解
        2 材料
            2.1 细胞系
            2.2 主要试剂
            2.3 自配试剂
            2.4 主要仪器设备
        3 实验方法
            3.1 细胞培养
            3.2 蛋白免疫印迹反应(Western blot)
            3.3 免疫共沉淀(Co-IP)
            3.4 统计学分析
        4 结果
            4.1 在HepG2-Sorafenib Resistant细胞中降低FAT10 促进NEDD4 的泛素化降解
            4.2 在Huh7-Sorafenib Resistant细胞中降低FAT10 促进NEDD4 的泛素化降解
            4.3 FAT10 通过调控NEDD4 的蛋白酶体使其降解
            4.4 FAT10 抑制NEDD4 的泛素化水平
        5 结论
        6 讨论
全文总结
致谢
参考文献
攻读学位期间的研究成果
综述
    参考文献



本文编号：3710787